稳健培养小鼠肝类器官

HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）

尽管肝脏在体内具有明显的再生能力，但肝脏组织的体外持续培养仍然是研究人员面临的挑战。最近，类器官培养技术的发展为肝脏研究领域提供了维持肝细胞持续培养的便捷方法1, 2。

类器官是自我组织形成的三维（3D）细胞培养物，包含所代表器官的一些细胞类型和关键特征。由于维持了干细胞和祖细胞的增殖能力，上皮类器官在培养物中维持培养远远优于离体原代细胞的培养。

肝祖细胞类器官的培养源于祖细胞的扩增，祖细胞被认为位于肝管内。与其他一些上皮类器官培养系统相比，肝祖细胞在类器官的培养中自发性分化水平非常低。肝祖细胞形成的球状类器官，具有双能性，转移至分化培养基后，可进一步分化1,2。

HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）是一种无血清的培养基，可以从小鼠肝脏组织快速生成肝祖细胞类器官。起始样本可来源于肝管、肝管小段、单个细胞或冷冻保存的类器官，并在Corning® Matrigel® 液滴（domes）中培养，或在含有稀释的Matrigel®培养基中进行悬浮培养（suspension）。接种后24小时即可观察到肝类器官，一周内可以进行传代，稳定的提供肝细胞。

生长在HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中的肝类器官表达肝祖细胞、肝管以及低水平的成熟肝细胞标志物。以类器官扩增肝祖细胞，更简便的在体外模拟了肝上皮的生理特征，减少了使用动物的需要。

为什么要使用HepatiCult™？

方便。一周内即可在体外生成类器官。

清晰的标准操作流程。无需使用肝损伤小鼠模型，无需手工挑选肝管或进行细胞分选。

简单，双组分。不含血清，培养基成分确定。

灵活。起始样本可来源于肝管小段或单个细胞，培养方法可使用胞外基质凝固液滴（matrix dome）或悬浮培养。

图1. 在 HepatiCult™ 类器官生长培养基（小鼠）中生长的肝类器官

HepatiCult™ 类器官生长培养基（小鼠）支持（A）Matrigel®液滴（dome）或（B）含有稀释的Matrigel®培养基的悬浮（suspension）培养。类器官为培养至第15代的第7天时进行拍照。

图2. 小鼠肝祖细胞类器官可来源于各种起始样本。

无论是从（A）肝管小段（B）单个细胞或（C）冷冻保存的类器官，都可在HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中生成肝祖细胞类器官。所有的类器官在 Matrigel®dome中生长，并在原代培养的第7天或解冻后的第1代（冷冻保存的类器官）成像。

图3. 肝祖细胞类器官可使用Matrigel®dome或Matrigel®suspension的方法进行培养。

从新鲜分离的小鼠肝管组织来源，在HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中培养的肝祖细胞类器官，可使用（A）Matrigel® dome或（B）Matrigel®suspension的方法。两种培养条件下生长的类器官可在4 - 7天内传代。

图4. 在HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中生长的类器官显示出一些典型的成熟肝上皮特征。

（A）肝祖细胞类器官呈现肝上皮典型的多边形形态。（B）肝祖细胞类器官显示出双核（箭头），此为成熟肝细胞的共同特征。（C）免疫细胞化学分析显示MRP4（绿色）的分布为沿着类器官外部；MRP4是一种膜结合、单向性外排转运蛋白。DAPI（红色）的分布位于细胞核。这表示类器官的细胞出现极化，因上皮基底外侧表面远离管腔的。（D）Ki67（红色）染色呈阳性结果，显示肝类器官含有活跃增殖的祖细胞群。细胞核用DAPI（蓝色）进行染色。

图5. 类器官基因表达水平分析。

通过RNA-seq分析标志物得表达，在HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中培养的类器官，无论是使用Matrigel® dome或稀释的Matrigel® suspension的方法，都表达与肝脏干/祖细胞相关的标志物。类器官还表达出低水平的与成熟肝细胞相关的标志物，包括胆管细胞和肝细胞。纵列代表第1 - 40代培养物的生物学重复结果。

图6. 在HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中类器官的扩增。

使用HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）培养的类器官可以在多次传代后依旧显示高效生长。培养物在每次传代时的平均传代比例（split ratio）为1:25。

图7. 肝祖细胞器官的分化。

生长在 HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）（EM）中的肝祖细胞类器官可转换至分化培养基（DM）中分化成更类似于成熟细胞的类型。转换到分化的培养基后1, 2，肝类器官显示成熟肝脏标志物，包括（A）Hnf4a和（B）Alb的上调，而肝干/祖细胞标志物如（C）Sox9和（D）Axin2则下调。导管标志物如（E）Krt19和（F）Hnf1β亦上调。每个标志物的相对量化（RQ）标准为18S和TBP管家基因。参照标准为在 HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中使用Matrigel® dome方法培养的肝祖细胞类器官。

参考文献

1. Huch M., et al. (2013) In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494(7436): 247-50.

2. Broutier L., et al. (2016) Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11(9): 1724-43.