Raybiotech 抗体芯片在FGR-pMSCs血管生成障碍因素筛选中的应用

杂志名称：Stem Cell Reviews and Reports

文献题目：Mesenchymal stem/stromal cells from the placentae of growth

restrictedpregnancies are poor stimulators of angiogenesis

第一作者：Anandita Umapathy

通讯作者：Anandita Umapathy

作者单位：奥克兰大学医学与健康科学系妇产科

本实验所用产品：QAH-CAA-440

实验样品：细胞培养上清

研究背景：

    胎盘是调节母体和胎儿循环之间营养和气体交换的重要器官。在整个妊娠过程中，胎盘内广泛分支的血管网络对于母胎交换至关重要。

    胎盘血管系统的快速和持续生长依赖于血管生成和血管生成的过程。在妊娠晚期，末端毛细血管环向合体滋养层细胞突起，从而最大限度地减少胎儿和母体循环之间的交换距离。在胎儿生长受限（FGR）胎盘中，末端毛细血管环的延长和分支失败以及胎盘动脉分支的显著减少将导致胎盘血管密度降低，从而降低母胎间交换能力，导致胎儿在出生时病理性较小。

    胎盘内血管附近的胎盘间充质干细胞/基质细胞（pMSCs）和胎盘巨噬细胞分泌的促血管生成因子和抗血管生成因子可调节胎盘血管发育，FGR中这些因子分泌失衡可能导致血管发育受损。然而，pMSCs如何在胎盘血管发育过程中启动促血管生成信号，以及该作用在妊娠障碍中是否受损尚不清楚。

1 结果

1.1     pMSCs的描述

    利用流式细胞术，采用三个阳性标记物（CD90+、CD105+和CD73+）和三个阴性标记物（CD45-、CD34-和CD31-）对分离的MSC进行表型鉴定。（Fig. 1A-F）。AlamarBlu细胞增殖实验结果表明，与正常pMSCs相比，FGR的PMSCs的增殖速度显显著降低（Fig.1G）。

    用Raybiotech公司检测了440种细胞因子的抗体细胞因子芯片检测pMSC-CM（条件培养基）和基础培养基组别间分泌蛋白组的差异表达，共鉴定出在pMSC-CM中显著上调的46个细胞因子。对MSCs分泌的细胞因子进行通路富集，结果显示pMSCs参与了发育、炎症反应、血管生成、血管发育和防御反应等一系列过程（Supplementary Table 2）。其中，有10个是促血管生成细胞因子（丛生蛋白、血管生成素、OPG、VEGF、TGF-β1、AXL受体酪氨酸激酶、CXCL16、FGF-9、OSM和Ang-1），有3个为抗血管生成因子（TSP-1、IGFBP-4和decorin）。

1.2   GR的pMSCs明显抑制血管生成

    为了确定pMSCs在胎盘血管生成中的作用，将采集自正常或FGR的MSCs的条件培养基用于内皮细胞管形成实验。与正常pMSC-CM相比，FGR的pMSC-CM显著抑制大血管内皮细胞（HUVECs）和微血管内皮细胞（HMEC-1）的平均管长（Fig. 2）。

1.3 在FGR的pMSC-CM中巨噬细胞明显抑制管状细胞的形成

    佛波酯和IL-4诱导分化可诱导巨噬细胞M2型极化。经佛波酯和IL-4诱导后，U937巨噬细胞系的CD11b、CD163和CD206表达上调，证实分化后的U937为M2型极化（Fig. 3）。

为了确定pMSCs的分泌蛋白是否影响巨噬细胞对胎盘血管生成的调节，用正常MSC-CM或FGR的pMSC-CM刺激M2型分化U937细胞。与正常的pMSC-MCM相比，FGR的pMSC-MC对平均管长有抑制作用（Fig. 4）。

1.4 正常的pMSCs与FGR的pMSCs分泌的抗血管生成细胞因子无显著差异

    为进一步探究抗血管生成细胞因子是否影响FGR的血管生成，用qRT-PCR和ELISA检测pMSCs分泌的3种抗血管生成细胞因子（TSP-1、IGFBP-4和decorin）的基因和蛋白表达。结果表明，SP-1、IGFBP-4和decorin的mRNA和蛋白表量在正常胎盘MSCs与FGR的pMSCs间均无显著性差异（Fig. 5）。

结论：

    在本研究中，通过内皮管形成实验，作者发现来自FGR的pMSC-CM显著抑制内皮管的形成。同样，来自FGR的pMSC-CM中的巨噬细胞刺激内皮管形成的能力较差。通过用Raybiotech抗体细胞因子芯片分析在pMSC-CM组和基础培养基组间差异表达的分泌蛋白，找到10个显著上调的促血管生成因子和3个抗血管生成因子。通过qRT-PCR和ELISA验证正常组和FGR-pMSCs组分泌的抗血管生成细胞因子的表达情况，结果表明两组间三个抗血管生成细胞因子均无统计学意义。这些数据提示FGR-pMSCs分泌旁分泌因子的功能失调参与血管生成障碍过程。结果表明胎盘中促血管生成细胞类型之间的相互作用对于充分的血管生成可能是至关重要的。