STEMdiff™--中胚层诱导培养基

STEMdiff™中胚层诱导培养基（MIM）是一种成分确定、无异种成分的培养基，用于将人胚胎干（ES）细胞和诱导多能干（iPS）细胞生成早期的中胚层细胞。一般来说，中胚层分化的实验流程比较困难且结果往往不一致，因此，使用STEMdiff™ MIM，通过简短且易于操作的单层培养流程（图1），即可将人多能干细胞（hPSC）分化为高品质的早期中胚层。

STEMdiff™ MIM生成的细胞群富集了早期中胚层，其标志为Brachyury（T）和NCAM的阳性以及OCT4的阴性表达（图2-4）。作为hPSC工作流程的一部分，STEMdiff™ MIM与在TeSR™培养基中培养的hPSCs相兼容，并可有效将使用mTeSR™1或TeSR™-E8™培养的hPSCs进行分化（图3）。当加以定向诱导时，以STEMdiff™ MIM生成的早期中胚层细胞可进一步分化为特定的细胞类型，如：间充质干细胞及其衍生物（成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞），以及内皮细胞（图5-6）。
STEMdiff™ MIM的优势：
• 成分确定，且无异种成分。
• 仅在分化后2 - 4天即可迅速进行中胚层诱导。
• 可对多种人ES和iPS细胞系进行有效且可重复的分化。
• 生成早期中胚层细胞，能够分化为多种下游细胞类型。

图1. 中胚层诱导培养基分化时间轴示意图
在第0天收获hPSC集落，并将其制备成单细胞，以5 x 104个细胞/cm2接种于mTeSR™1或TeSR™-E8™中，同时加入10 μM的Y-27632。在第1天，细胞融合约20 - 50%时，将TeSR™培养基更换为STEMdiff™中胚层诱导培养基。然后在STEMdiff™ MIM中培养（第2-4天），每天更换培养基。细胞在第3 - 5天可被转移到下游分化条件中，或在第5天收集进行分析。

图2. STEMdiff™ MIM可生成早期中胚层（表达T+OCT4-）的同源性细胞群
(A) 数据显示了实验流程第5天的早期中胚层标志物的表达特征（Brachyury（T）阳性表达和OCT4和SOX 17阴性表达）。数据为表达每个标志物的细胞的平均百分比± SD，n = 33（T，OCT4），n = 5（SOX17）。(B) 未分化细胞标志物（OCT4、SOX2、NANOG）和早期中胚层标志物（T、MIXL1、NCAM）的表达，通过定量PCR（qPCR）测定，并归一化到未分化的细胞水平，n = 2。

图3. 对于多个hPSC细胞系，中胚层分化和细胞扩增均有效且效果相当
图示为多个人ES（H1和H9）以及iPS（WLS-4D1、WLS-1C、STiPS-M001和STiPS-F016）细胞系中形成的中胚层，都能检测到Brachyury（T）阳性和OCT4阴性的表达。使用STEMdiff™ MIM对维持于 (A) mTeSR™1或 (B) TeSR™-E8™培养基中的细胞进行分化（A，n = 2 - 10/细胞系；B，n = 3；数据为平均百分比± SD）。(C) 在Corning® Matrigel®或Vitronectin XF™中进行中胚层分化，其效果相当（n =5，数据为平均百分比± SD）。(D) 在STEMdiff™ MIM中所培养细胞的平均扩增倍数，由细胞产量/接种细胞数确定（n = 3 - 13，误差线表示SEM）。

图4. 经STEMdiff™ MIM处理的细胞，其表型与早期中胚层相符
典型流式图显示hPSCs从 (A) 培养于mTeSR™1中时表达EpCAM+NCAM-/low转变为(B) 以STEMdiff™ MIM处理后表达EpCAM-/lowNCAM+（第5天）。EpCAM-/lowNCAM+的表达是早期中胚层的特征。在 (C) 以mTeSR™1培养的hPSCs和 (D) 以STEMdiff™ MIM生成的早期中胚层中，PDGFRα和KDR的表达均较低。
下游分化：

图5. 由早期中胚层细胞生成的间充质干细胞可进一步在体外实验中分化
(A) 将5天STEMdiff™ MIM流程生成的早期中胚层随后培养于MesenCult™-ACF中，形成具间充质干细胞（MSC）样的形态（40X放大倍率）。MSC样细胞随后可以分化为 (B) 脂肪细胞（油红O染色），200X放大倍率；(C) 软骨细胞（阿尔辛蓝染色），100X放大倍率；和 (D) 成骨细胞（快速红色和硝酸银染色），40X放大倍率。

图6. STEMdiff™ MIM生成的早期中胚层细胞具有高效的内皮细胞分化潜能

在进行STEMdiff™ MIM流程的第3天，对早期中胚层细胞转换为进行内皮分化流程（Tan et al.1）。(A) 分化的细胞显示典型的内皮细胞形态并(B) 能够吸收Dil-Ac-LDL（红色）。典型流式图显示在分化的内皮细胞中有(C) 85.5%的细胞表达CD144+CD31+和(D) 87.6%的细胞表达CD105+KDR+。

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