ALDEFLUOR™ --基于乙醛脱氢酶的细胞检测试剂盒

产品描述

ALDEFLUOR™试剂盒用于检测表达高水平乙醛脱氢酶（Aldehyde Dehydrogenase, ALDH）的人细胞。经活化的ALDEFLUOR™试 剂，即BODIPY™-氨基乙醛（BODIPY™-aminoacetaldehyde， BAAA）是一种针对ALDH，带有荧光标记的无毒底物，可通过自由 扩散进入具有完整细胞膜的活细胞。当存在ALDH时，BAAA被转化 为BODIPY™-氨基乙酸盐（BODIPY™-Aminoacetate，BAA），被保留在细胞内。荧光反应产物的产量与细胞中ALDH的活性成正比，可使用流式分析进行检测。原则上，ALDH-明亮（ALDHbr）的活细胞可用细胞分选仪进行分离。ALDEFLUOR™检测缓冲液中的外流抑制剂可抑制反应产物的外流。针对ALDH的特异性抑制剂 - 二乙氨基苯甲醛（Diethylaminobenzaldehyde，DEAB）可用于背景荧光的对照。

ALDEFLUOR™优化于检测人血液和骨髓中的ALDHbr造血细胞，但也可用于非造血细胞。

组分

01703  ALDEFLUOR™干粉试剂 50 μg ；01705  ALDEFLUOR™二乙氨基苯甲醛（DEAB）试剂，溶于 95%乙醇，浓度为 1.5 mM 1 mL ；01704  盐酸（HCl），2N 1.5 mL ；01706  二甲基亚砜（DMSO） 1.5 mL ；01701  ALDEFLUOR™检测缓冲液 4瓶 x 25mL

稳定性和储存条件

该产品可在 2-8°C 下稳定保存，直至标签上的保质期。不可冷冻储存。 重配制和活化的ALDEFLUOR™试剂应在-20oC下保存。 活化的 ALDEFLUOR™试剂可在-20°C 下稳定保存一年。请勿反复冻融。

预防措施

ALDEFLUOR™ 试剂不具有细胞毒性。在该检测中， ALDEFLUOR™干粉试剂、DMSO和HCl的组合浓度即使高于其它组分浓度的100倍，也依然不具有细胞毒性和光毒性。DEAB对皮肤和眼睛具有刺激性。

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使用指南

ALDEFLUOR™的活化

所提供的ALDEFLUOR™干粉试剂是稳定（BODIPY™-氨基乙醛-乙 酸氨基丙二酸二乙酯，BAAA-DA）且无活性的。使用时，将 ALDEFLUOR™干粉试剂先溶于DMSO中，再经过2N HCl的处理， 最后以ALDEFLUOR™检测缓冲液稀释，将其转化为具有荧光活性 的ALDEFLUOR™试剂（BAAA）：

1. 集齐所有用具，并在使用前使试剂盒内的试剂达到室温（RT， 15-25°C）。

2. 向 ALDEFLUOR™干粉试剂的小管中加入 25 μL的 DMSO，混合均匀，并在 RT下静置 1分钟。 注意： ALDEFLUOR™ 干粉试剂是一种桔红色的粉末， 一加入 DMSO 即 变为亮黄绿色。

3. 加入 25 μL的 2N HCl，混合均匀，在 RT下将此混合物孵育 15分钟。 重要提示：如果在加入 DMSO 之前加入 2N HCl ，会导致产品失活。

4. 在小管中加入 360 μL的 ALDEFLUOR™检测缓冲液，并进行混合。 注意：加入 ALDEFLUOR™ 检测缓冲液后，溶液会略显浑浊， 这不会影响检测效果。

5. 在使用时保持活化的 ALDEFLUOR™试剂一直处于 2-8°C。 6. 将剩余的活化 ALDEFLUOR™试剂进行分装，并储存于-20°C 下（见“稳定性和储存条件”部分）。 注意：活化的 ALDEFLUOR™ 试剂浓度为 300 μ M 。

细胞样本的制备

1. 依据相应于细胞类型的标准操作流程制备新鲜或预先冻存的细胞样本。

2. 如果使用的血液样本中红细胞（RBC）与白细胞的比例 （RBC:WBC）> 2:1，请使用不含清洁剂或固定剂的氯化铵缓冲液（如：产品号 #07800/07850）裂解红细胞（请访问 www.stemcell.com以获取更多信息）。

3. RBC被裂解后，以 250 x g将样本离心 5分钟。去除上清液后，将细胞悬于 1 mL ALDEFLUOR™检测缓冲液中。

4. 进行细胞计数。

5. 如果使用造血细胞（如：外周血、单采术样本、骨髓或脐 血），则使用ALDEFLUOR™检测缓冲液将浓度调整为 1 x 106 个细胞/mL。 注意：对于其它细胞类型，可能需要不同的细胞浓度。请见第 4 页的“ ALDEFLUOR 检测优化 ”部分，以查阅对非造血细胞进行染色条件优化的建议。

ALDEFLUOR™检测（见图1）

1. 对每个要检测的样本都分别标记一个“检测”管和一个“对 照”管。在每个“检测”管中均加入 1.0 mL经调整的细胞悬 液。

2. 向“对照”管中加入 5 μL的 ALDEFLUOR™ DEAB试剂。然 后立即将对照管和 DEAB小管的管盖重新盖上。 注意： ALDEFLUOR™ DEAB 溶于 95% 的乙醇中。立即 重新盖 上管盖 以防止 蒸 发 。

3. 在第一个样本“检测”管中，对于每 mL样本加入 5 μL活化的 ALDEFLUOR™试剂。混合均匀并立即取出 0.5 mL混合物迅速 转入 DEAB“对照”管中。 注意：向细胞悬液中一加入活化底物， ALDH 的酶反应就会立即开始。因此必须将已与 ALDEFLUOR™ 反应的细胞立即加入 DEAB 对照管中，不可延迟。

4. 向每个接受检测的样本中加入步骤 2和 3中制备的对照物和底物溶液。

5. 将“检测”和“对照”样本在 37°C下孵育 30 - 60分钟（不要超过 60分钟）。 注意：最佳的孵育时间会根据不同的细胞类型而有所不同。请见第4页的“ ALDEFLUOR 检测优化 ”部分，以查阅对不同细胞类型进行染色条件优化的建议。

6. 孵育后，以 250 x g 将所有试管离心 5 分钟并去除上清液。将 细胞团重悬于 0.5 mL 的 ALDEFLUOR™ 检测缓冲液中，并 将细胞置于冰上或 4°C 环境中 。

注意：如须进行 免疫表型的检测 ，则在步骤 6 之后加入抗体并进行 孵育。为防止 ALDEFLUOR™ 产物的外流，在 ALDEFLUOR™ 检测缓冲液中进行抗体孵育是非常重要的 。 尽可能保持细胞在低温状态下（ 4°C 或置于冰上） ，以减缓反应 产物的外流。

7. 可选步骤：对活细胞进行计数。如果您的样本中活细胞含量小于 90%，则推荐用 DNA染色剂（如：碘化丙啶或 7actinoaminomycin-D）对细胞进行染色，以辨别死亡或即将凋亡的细胞。

图 1. ALDEFLUOR™的检测

流式分析实验的建立和数据采集

1. 建立一个正向散射（FSC）: 侧向散射（SSC）的散点图

2. 在set-up模式下，将DEAB对照样本放入流式细胞仪中。调整 FSC和SSC的电压，使有核细胞群处于FSC:SSC散点图的中心位置。划定一个区域R1，将有核细胞的散点包含在其内部。

图 2. FSC:SSC 散点图

上图为FSC:SSC散点图，划定的R1区域包含所有有核细胞的散点，RBCs 和细胞碎片则划在门外。该图显示了人骨髓单个核细胞的代表性数据。

3. 创建一个荧光通道 1（FL1）: SSC散点图，以 R1设门。

4. 在 FL1:SSC散点图中，调整 FL1光电倍增管的电压，以使 DEAB对照样本中已染色细胞群的右边界处于散点图的第二个对数级上（见图 3A的示例）。然后移走试管。

5. 在流式细胞仪中加入对应的ALDH检测样本。划定一个区域 R2，将ALDH-明亮（ALDHbr）的细胞群包含在其内部（见图 3B的示例）。然后移走试管。

图 3. 使用 ALDEFLUOR™ 染色的人骨髓单个核细胞的 ALDEFLUOR™荧光:SSC 散点图。

以R1区域设门的ALDEFLUOR™荧光:SSC散点图是基于对照（A）和检测（B）样本数据所创建的。划定的R2区域包含所有ALDHbr细胞。该图显示了人骨髓单个核细胞的代表性数据。

6. 数据采集：自分析仪的 set-up中撤出，在相同的仪器设置条件 下，在 R1区域中，对每个检测和对照样本采集 100,000个散 点数据。

7. 如图 3B所示：人血液和骨髓中的ALDHbr细胞群通常显示较低的侧向散射。非造血细胞（如：乳腺癌细胞系，或原代乳腺细 胞）呈现不同的SCC属性，因此需要相应进行设门（见图 4和 图 5的示例）。

图 4.使用 ALDEFLUOR™染色的 SKBR3 细胞系的 ALDEFLUOR™ 荧光:SSC 散点图。

图 5. 使用 ALDEFLUOR™ 染色的人原代乳腺细胞的 ALDEFLUOR™荧光:SSC 散点图。

ALDHbr细胞的比例，ALDEFLUOR™和背景荧光的强度都取决于样本类型。 请对每种样本都使用独立的DEAB对照，以确保分析的准确性。

重要提示：在接触了活化的 ALDEFLUOR™ 试剂 后，所有细胞膜完整的活细胞都将呈现荧光。对于暴露于 ALDEFLUOR™ 的细胞样本， 只有加入 ALDH 抑制剂 - DEAB 的样本是唯一适合的阴性对照。 只有与 DEAB 对照样本的背景荧光水平进行比较后，才能识别出呈现高 ALDH 活性的细胞 。

流程提示及窍门

• 新鲜或预先冻存的样本可用于ALDHbr细胞的分析。但是， ALDEFLUOR™试剂盒只能对具有完整细胞膜的活细胞中的 ALDH活性进行检测。

• 需要从样本中去除红细胞。可使用不含清洁剂或固定剂的试剂 （如：氯化铵缓冲液，产品号 #07800/0785）裂解红细胞，或通过密度梯度离心去除红细胞（请访问www.stemcell.com以获取更多信息）。

• 当将冻存的，活化的ALDEFLUOR™试剂进行解冻时，会观察到 有小沉淀物（颗粒）。使用前请混悬解冻的试剂以打散沉淀物。 该沉淀物不影响检测效果。

• 细胞系A549（源于肺癌）、SKBR3（源于乳腺癌）和K562（源 于慢性粒细胞白血病）表达ALDH活性，可做为ALDEFLUOR™ 检测的阳性对照。

• 为提高对多种细胞样本中稀少的ALDHbr细胞的鉴定效果，可以在进行ALDEFLUOR™检测前，依据谱系抗原的表达去除成熟造血细胞，以及使用RosetteSep™人祖细胞富集试剂盒或EasySep™ 人CD34正选试剂盒富集ALDHbr细胞。请参阅第1页的“相关产 品”部分，以获取更多信息。

ALDEFLUOR检测的优化

该ALDEFLUOR™检测最初被开发和优化于检测人脐血、骨髓和动员后的外周血中的造血干细胞和祖细胞。对于检测非造血细胞、培养的细胞和细胞系的 ALDH 活性，可能需要不同的检测条件和流式 细胞仪的设置，以达到最佳的检测效果。

优化细胞样品的浓度

使用ALDEFLUOR™检测缓冲液，将需要检测的细胞制备为包含一系列细胞浓度的样本，并进行ALDEFLUOR™检测。重要的是：每个细胞浓度都应有一个DEAB对照样本，因为对于不同的细胞浓度，其ALDEFLUOR™染色的细胞可能会有不同的背景荧光信号。 建议每mL ALDEFLUOR™样本的细胞浓度为： 1 x 10^5， 2 x 10⁵ ，5 x 10^{5 ，}1 x 10^6， 2 x 10⁶ 请采用可使ALDHbr细胞显示最强的荧光强度，以及与背景间有最高 信号比的细胞浓度；对于多种不同的细胞样本，应采用可最佳区分 ALDH-明亮细胞和ALDH-低含量细胞的细胞浓度。

例如，对于呈现ALDH表达的SKBR3乳腺癌细胞系，最佳的细胞浓度应定为约2 × 10⁵个细胞/mL（见图6）。

图6：对于SKBR3细胞系，细胞浓度对ALDEFLUOR™活性检测效 果的作用。

优化孵育时间

采用最佳的样本浓度，在37oC下测试不同的ALDEFLUOR™孵育时间。

建议的孵育时间为：  15分钟 30分钟 45分钟 60分钟

例如，对于SKBR3细胞系，最佳的孵育时间应定为45分钟（见图 7）。

图7：对于SKBR3细胞系，孵育时间对ALDEFLUOR™活性检测效果的作用。

优化对外流抑制剂的选择

为防止活化的ALDEFLUOR™试剂（BAAA）和反应产物（BAA） 的外流，ALDEFLUOR ™检测缓冲液含有外流抑制剂，可抑制表达 于大多数细胞中的ABC转运蛋白的活性。该ALDEFLUOR™检测缓 冲液的配方经过优化，可防止从造血干细胞和祖细胞中外流，同样也适用于许多非造血细胞。但是，为了对非造血细胞中ALDH活性 的检测进行优化，在不同浓度下测试加入各种抑制剂的效果可能是 一种行之有效的方法。推荐的抑制剂和建议浓度包括：维拉帕米 （Verapamil），50-100 μM；丙磺舒（Probenecid），2.5 mM； 和2-脱氧-D-葡萄糖，100 mM。

活化的ALDEFLUOR™试剂和产物的外流也可在低温下被抑制。为防止荧光强度的损失，建议在ALDEFLUOR™反应结束后，将细胞置于冰上或2 - 8°C环境中。另外，还建议在进行细胞分选时保持细胞处于低温状态。

优化对阴性对照的使用

提高ALDH抑制剂 - DEAB的浓度，对于检测具有高ALDH活性的细胞的背景荧光检测可能行之有效。为找到最佳的DEAB浓度，可尝试将每次反应中抑制剂的量都增加一倍。也许有必要进一步显著提高使用量（高达10倍）。然而，这可能对细胞样本的活性有负面影响。

也可以采用在添加活化的ALDEFLUOR™试剂前向细胞中加入抑制剂的方法增加DEAB抑制剂的作用效果。其操作方法是：准备2支试 管（1支对照和1支检测），加入等体积的细胞悬液（为推荐浓度）。在对照管中对于每mL细胞悬液加入10 μL的DEAB，混合均匀。然后在每支试管中对于每mL细胞悬液加入5 μL活化的 ALDEFLUOR™试剂，并立即混合均匀。