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ReleSR™:无需手工刮擦的hPSC传代方法

对人多能干细胞(hPSC)进行传代的常规流程耗时耗力,通常包括以下步骤:通过手工方法吸取或刮擦以去除分化的细胞,接着解离贴壁集落,使它们从基质上脱落,最后将其刮擦下来以形成细胞聚集体或者单细胞。由于使用单细胞反复传代会导致染色体畸变的累积。因此目前仍主要推荐基于聚集体的标准传代方法。

2015年,一种新型的无酶传代工具ReLeSR(#05872)问世,它无需手工刮擦,将hPSC从培养皿上分离,而分化的细胞仍保留在培养皿上。使用ReLeSR传代hPSC可轻松生成大小最合适的聚集体,且可避免人工操作所导致的困难和差异。另外,由于无需再进行刮擦,大大节省了时间。ReLeSR还可与培养瓶或其它密闭容器相兼容,与mTeSR1(#05850)、TeSR-E8(#05940)、Vitronectin XF(#07190)和Matrigel(#354227)(www.nwbiotec.com)配合使用。

ReLeSR传代流程:

01.在开始传代前至少提前1小时,使用Vitronectin XF或Matrigel(#354277)包被新的培养板。

02.分装足量的mTeSR1或 TeSR2(#05860)完全培养基并预温至室温(15-25℃)。

03.以6孔板为例。用1 mL不含Ca2+和 Mg2+的PBS缓冲液(#37350)洗细胞后,吸出PBS溶液。

04.加入ReLeSR 1mL/孔,并且在一分钟内吸出ReLeSR,使集落暴露在薄薄一层液体中。

05.孵育时间:

• mTeSR1培养物:37°C 孵育 5 - 7 分钟

• TeSR2 培养物:室温(15 -25°C) 孵育5 – 8分钟

• TeSR-E8培养物:室温(15 -25°C) 孵育7 – 9分钟

注意:根据不同细胞系和集落生长状态,孵育时间可进行优化。

06.加入1 mL mTeSR1 或 TeSR2维持培养基。

07.室温下,用培养板振荡器震荡解离细胞2-3分钟。或者,也可以用一只手拿着培养板,另一只手轻弹培养板约30-60秒。

08.将解离的细胞团用5 mL吸管转移至15 mL试管中。细胞团大小大约为50-200 μm为宜。

注意:如果镜下观察仍有较大的聚集体未被解离成小团块,可用5 mL移液管上下轻轻吹打一次(仅吹打一次),以确保较大的聚集体解离为合适大小的细胞团。

09.以所需的密度将细胞聚集体混合物接种到预先包被的添加有mTeSR1或 TeSR2维持培养基的培养孔中(2 mL/孔)。

10.将培养板放置在37°C 培养箱中。快速前后左右多次移动6孔板,使其中的细胞聚集体分散于培养孔表面。在之后的24小时内请勿扰动培养板。

11.每天更换培养基,观察和评估培养物以监测其生长情况,并确定下一次的传代时间。


图示 ReleSR对培养于mTeSR1培养基上的hPSC的作用效果

以ReleSR消化获得的理想聚集体(步骤8)(平均大小约50-200μm)为例。图像采用两个放大倍率:(A)40x和(B)100倍。如果细胞聚集并不像例子中所示,那么传代的流程可能需要进一步的优化。