GCDR（温和解离试剂）传代PSCprotocol

在无饲养层条件下培养的hPSC可通过刮擦和/或传代酶（如分散酶）将集落解离成团块后进行传代。但是此过程十分耗时，且团块的大小很难控制。虽然酶传代的效果不错，但酶会消化细胞外蛋白，导致细胞壁损伤，且需要在种细胞之前使其失活。无酶传代工具由此应运而生。

温和细胞解离液（Gentle Cell Dissociation Reagent, GCDR，货号 #07174）是一种不含酶的试剂，适用于将hPSC解离为细胞团块进行常规传代，也可解离成单细胞进行传代。不会破坏细胞表面蛋白，无需进行失活处理，对细胞十分温和，可以使传代比例大大提高。

以下是使用6孔培养板的相关说明。如果使用其它培养器皿，则可对其体积做相应调整。

1.在开始传代前至少提前1小时，使用Vitronectin XF或Matrigel包被新的培养板。

2.分装足量的mTeSR1或TeSR2完全培养基并预温至室温（15- 25℃）。

注意:不要在37℃水浴中加热mTeSR1或TeSR2完全培养基。

3.通过显微镜观察并鉴定已分化的区域。用马克笔或透镜标志器在培养板底部标记这些区域。用移液枪头或吸引器去除标记区域内这些分化的部分。每次操作时避免将培养板在培养箱外持续放置超过15分钟。

注意:如果分化<5%，则未必需要对集落进行挑选。品质很好的培养物，标记的区域不应超过培养孔的20%。

4.从培养孔中吸出培养基，并在每孔中加入1 mL的GCDR。在室温下（15 - 25℃）孵育，孵育时间见表1。

表1.GCDR在不同基质胶包被培养皿中的孵育时间

5.从培养孔中吸出培养基，并在每孔中加入1 mL的mTeSR1或TeSR2维持培养基。

6.使用一次性移液管（Biologix，货号 #07-5002）或细胞刮（Biologix，货号 #70-1180）轻轻刮除集落。

注意:操作时要务必小心，尽量防止集落解体。

7:将刮取下来的细胞聚集体转移到一个15mL锥形管中。

注意:不必对细胞聚集体进行离心。

8.用移液管小心上下吹打细胞聚集体混合物，以将其打散至所需的大小。关于如何打散不同类型基质上生长的细胞聚集体，请参考表3。不要将其制备成单细胞悬液。

表2. 不同基质上生长的细胞聚集体推荐打散时间

9.将细胞聚集体混合物接种到已预先包被有基质的、含有mTeSR1或TeSR2完全培养基的培养孔中（2mL/孔）。当集落密度为最佳状态时，可以每4- 7天对培养物以1:10至1:40的比例进行一次分配（即将1个培养孔内的细胞聚集体分别接种到10- 40个新的培养孔中）。如果集落过于密集或过于稀疏，则在下一次传代时相应调整分配比例。

注意:将细胞聚集体迅速转移到新的培养皿中，以最大限度地提高其存活率及贴壁率。

Tips:传代时向mTeSR-1培养基中加入10 μM小分子抑制剂 Y-27632 能有效提高细胞的传代品质，减少细胞的死亡。

10.将培养板放置在37℃培养箱（含5% CO2和95%的湿度）中。快速前后左右多次移动6孔板，使其中的细胞聚集体分散于培养孔表面。在之后的24小时内请勿扰动培养板。

注意:确保新接种的细胞聚集体均匀分布于培养板的整个表面。分布不均匀有可能导致hPSC的分化。

11.每天更换培养基，观察和评估培养物以监测其生长情况，并确定下一次的传代时间。

图1.温和细胞解离试剂（GCDR）对培养于Vitronectin XF基质和mTeSR1培养基上的人hESC的作用效果。GCDR孵育不同时间的hESC（H9）。图像在20X、40X和100X三个放大倍率下获得。位于集落边缘的细胞之间出现间隙时，即达到推荐的孵育时间（6 - 8分钟）。在较早的时间点集落没有被充分解离，而在较晚的时间点集落则会过度解离，导致在刮取时可能散开形成单个细胞。请注意孵育时间会因为使用的细胞系的不同，或使用其它不含酶的细胞解离试剂而有所不同，因此应在显微镜下监测解离情况进程，直至可确定已到达其最佳时刻。

图2. 温和细胞解离试剂（GCDR）对培养于Matrigel基质和mTeSR1培养基上的人iPSC的作用效果。在使用GCDR进行孵育的过程中，不同时间点的人iPSC（STiPS-M001）。图像在20X、40X和100X三个放大倍率下所采集。位于集落边缘的细胞之间出现间隙时，即达到推荐的孵育时间（6 - 8分钟）。在较早的时间点集落没有被充分解离，而在较晚的时间点集落则会过度解离，导致在刮取时可能散开形成不想要的单个细胞。请注意孵育时间会因为使用不同的细胞系，或使用其它不含酶的细胞解离试剂而有所不同，因此应在显微镜下监测解离情况进程，直至可确定已到达其最佳时刻。