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CD34+造血干细胞的分选、扩增和功能检测

背景介绍 :
人体内含有数十亿计赖以生存的成熟血细胞,成熟血细胞的寿命有限,在人的一生中需不断地进行补充。而这些血细胞都是通过一群数量很少的造血干细胞(HSC)的分化增殖产生。同时,HSC也能通过自我更新对自身进行补充。由于人的造血干/祖细胞表面特异的表达CD34蛋白,因此也被称为CD34+细胞。CD34+细胞的含量通常很低,在骨髓中约1-5%,在脐带血中约1%,外周血中含量甚至低于0.1%(所以如果从外周血中分选CD34+细胞,要应用动员过的外周血)。
业内研究造血领域的课题很多,本期小编针对CD34+细胞的分选、扩增及功能检测做了技术整理,供留存。
CD34+造血干细胞的获得:
目前获得造血干的途径主要是利用表面标记CD34,通过免疫磁珠法进行分选。
基本原理是:利用抗体对抗原的特异性识别,然后将磁珠偶联在抗体上,从而用磁珠将与细胞相连,利用磁性分离器的磁场,将标记了磁珠的细胞吸引并分离。免疫磁珠法分选细胞简单、快速,得到的CD34细胞纯度也很高。目前科研领域所应用磁珠分选试剂盒主要来自于是STEMCELL Technologies的EasySep免疫磁珠无柱分选和Miltenyi Biotec的分选柱磁珠分选。
此外,由于分选CD34+细胞的样本来源有限,直接购买高纯度、高活性的CD34+原代细胞也逐渐成为许多研究人员上佳的选择(有原代细胞需求的童鞋可以和我们咨询哦)。 
CD34+细胞的扩增:
由于CD34+细胞含量稀少,在分离得到CD34+细胞之后,对所得细胞进行扩增培养,从而达到实验所需的细胞量。体外维持、扩增和分析造血干细胞和祖细胞的能力推进我了们对造血的理解。
以前,用于培养造血干细胞的培养基都含有胎牛血清。但是,在不同血清批次之间,抑制因子,包括转化生长因子-β的浓度和其他成分会有所不同。为了尽可能减少这些批次间差异,尤其是特定刺激因子对培养物的影响,目前越来越多的研究对使用无血清培养基感兴趣。这些无血清培养基是造血祖细胞的扩增的理想选择。在添加了适当的细胞因子(如IL-3、IL-6、SCF、Flt3L、TPO、GM-CSF和G-CSF)培养基中培养CD34+细胞,在几天内,CD34+细胞可获得大量扩增。
对于6孔板来讲,一般以<1 x 105细胞/孔的接种密度进行培养,培养时间不能太长,一般2-3天为宜,最长不超过7天,否则CD34+细胞仍会发生分化。
目前应用最多的CD34+扩增培养基是STEMCELL Technologies的StemSpan 系列。并且,相应的细胞因子也以最优化的浓度制成可直接添加应用的细胞因子混合物,大大提高了实验效率,减少了摸索添加细胞因子浓度的工作量,同时节省了很多优化实验条件的成本。
温馨提示
有些朋友在应用StemSpan无血清培养基扩增造血祖细胞时未添加任何细胞因子,结果细胞全部game over。现在市售的培养基都是不含有细胞因子的完全培养基,方便研究人员根据要将研究目的,添加所需的细胞因子,扩增相应的目标细胞。而且目前对HSPC扩增的扩增、红系祖细胞的扩增、巨核祖细胞的扩增、髓系祖细胞的扩增都已经有作用确切的、配方优化的细胞因子混合物产品,应用起来又方便又可靠呀。
CD34+造血干细胞的功能检测:
1、CFU集落检测
集落形成单位(Colony-Forming Unit,CFU)检测,是目前体外检测造血祖细胞功能的金标准。目前最常采用的是应用甲基纤维素半固体培养基进行CFU集落检测,原因是:相比于琼脂等其他半固体培养基系统,血细胞集落在甲基纤维素中的生长得更好,在同一个培养皿中可同时检测红系、粒细胞/巨噬细胞和多向祖细胞的分化功能。此外根据是否观察红系集落,可选择含有EPO或不含EPO的甲基纤维素培养基。目前市场上应用最广泛的甲基纤维素半固体培养基品牌主要是STEMCELL Technologies。
2、LTC-IC检测
对于对与造血干细胞关系更加接近的造血祖细胞进行鉴定和计数,可通过长周期培养(Long Time Culture,LTC)来实现。通过LTC中检测出的细胞称作长期培养-启动细胞(LTC-IC)。LTC培养是将造血细胞培养在单层贴壁的基质细胞上。使用专门的长期培养的培养基,培养3周后(这个培养时间可确保在起始样本中所有的CFUs都完成分化)。将培养的细胞接种于CFU集落检测的MetroCult甲基纤维素半固体培养基上检测形成CFU的能力。此时,检测到的CFU一定是衍生于更原始的LTC-IC。通过有限稀释法确定每个LTC-IC形成的CFU数,从而确定样本中LTC-IC的含量。
3、CAFC检测
另外一种从LTC-IC检测演变而来的一种检测方法是鹅卵石样区域形成细胞(CAFC)检测。该检测方法以形态学标准,而非功能性标准来鉴定这些原始细胞。具体来说,CAFC检测是在几周内,在基质饲养层底部(称作“鹅卵石样区域”),察看是否存在能够生成暗反差(通过相差显微镜观看)区域的增殖细胞。该检测方法无需进行二次接种细胞,但是形态学检测的读数不能提供细胞分化潜能的信息。
4、CD34+造血干细胞的体内检测
该法是检测CD34+细胞功能的另外一种方式,也是检测人HSC细胞体内重建能力的金标准。
具体操作方法是:将细胞通过静脉注射或骨内注射到经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠中。通过流式分析检测数周(6-8周)后人血细胞在植入小鼠的血液、骨髓或其他器官中的阈值,若此阈值占总单个核细胞数目>0.1%则可定义为是成功的人HSC植入。
5、巨核细胞的检测
上面说到甲基纤维素半固体培养基,可使红细胞、粒细胞和巨噬细胞集落同时生长,但是,巨核细胞与巨噬细胞在集落形态上不易区分,所以对巨核细胞的鉴定需要进行染色,以此鉴定其特异性表面标记物或酶活性的表达。因此,若要在甲基纤维素的培养基中对培养的细胞进行细胞和分子分析,需要将集落进行挑取及处理,这项工作费时又费力。

胶原蛋白凝胶的优势是可进行脱水和固定,继而进行后续的细胞化学和免疫细胞化学分析,这就使胶原蛋白凝胶成为检测和定量巨核祖细胞的理想体系。而且,由于胶原蛋白凝胶可进行固定,所以可对正常和病态样本的记录进行长期保存,以此建立两者间的相关性,例如,特殊分子的表达与长期疾病预后的关联。

好了,今天内容到此结束,小编提醒大家,如果想获得具体的实验Protocol,一定要与我们联系哦。