8分钟RNA提取试剂盒注意事项和疑问解答

一、使用注意事项：

1、细胞数建议不超过300万，最多不超过500万，否则可能会堵塞离心柱。当细胞数较多时（例如使用6cm dish），裂解后可以先12000g离心1分钟，然后取上清加等体积乙醇，充分混匀后上柱，建议用 6 孔板或 35mm 培养皿培养细胞，细胞密度达到 70%以上较好。

2、为了防止吹打细胞时产生过多的气泡，可以在加入裂解液后，在室温放置 3~5 分钟，使细胞充分裂解，然后吹打 10 下。

3、为了减少裂解过程中气泡的产生，建议吹打时注意以下细节：吹时液体不要完全吹出，枪头里面可以留一点；吸时，液体也不要全部吸完，防止吸进去气泡。

4、吹打充分以后，可以直接将等体积无水乙醇加入孔板中，吹打 10 下，将可能出现的沉淀吹散，然后加入离心柱中，4000g（大约相当于 eppendorf 或 Thermo 离心机的 7000rpm）离心 1min，弃去液体；如果柱子中仍然有液体残留，可以用12000g离心。

5、对于细胞量很少的样品，或者对RNA产量要求较高的情况：

实验开始前可以先把洗脱液放到65度，加入洗脱液后，可以室温放置1~2分钟，使RNA充分溶解，然后离心，然后再将得到的RNA加入柱子中放置5分钟，重复洗脱一次。

6、洗脱液的体积不可太少或太多，建议通常加20~30微升洗脱液即可。

7、洗脱时，洗脱液一定要加到柱子中央的膜上，不能加到侧壁上，否则会因为 RNA 没有被溶解导致产量大大减少。

8、溶解时建议先放 2 分钟，离心 1 分钟，然后将液体吸出来，加入离心柱中央，再放置 3分钟，使 RNA 充分溶解，然后离心。离心后，RNA 应迅速转移到冰上放置并测浓度，进行后续实验。

9、如果实验对极少量的基因组残留很敏感，可以在4000g离心后，用随试剂盒附赠的DNA酶处理：每个样品的柱子中央加入12 ul稀释好的DNase（DNA 酶可以用 ddH 2 O 稀释，或者用 elution buffer 稀释，然后加入柱中央的膜上，室温放置 5 分钟，然后不要离心，直接加入 wash buffer 后，12000g 离心 1 分钟，洗涤后建议空柱离心一次，以充分去除可能残留的 wash buffer）

二、常见疑问解答

1、这个试剂盒能不能加入裂解液以后先冻存起来，等到样品都收集齐了再一起做？

答：细胞样品可以加入裂解液后，充分混匀，vortex震荡使细胞充分裂解，然后冻存于-80度。理论上能保存的时间跟TRIzol保存的时间相当。具体操作如下：

（1）弃去培养基，加200微升PBS，轻轻摇晃几下培养皿，弃去PBS。

（2）加500ul裂解液到孔板里，吹打10下，放置1分钟，吸出来到1.5毫升EP管里冻存在-80度。可以放置3个月。操作过程中如果样品多，可以分批操作，以免细胞被晾干导致细胞死亡RNA降解。

2、这个试剂盒能提的最小细胞量是多少？

答：常规的细胞（如293T等及常见的细胞，如癌细胞等），最低5万个就可以提出RNA，更少的细胞数需要自己尝试做优化。对于T、B细胞等免疫细胞，由于其体积远小于常规细胞（大约只有常规细胞的几十分之一），因此能提取的最低细胞数需要明显增加，一般建议500万以上，最低也需要100万以上。

3、关于组织RNA的提取，有什么需要注意的吗？

答：本试剂盒提取细胞样品的RNA最简便，提取组织样品时有一定的局限。组织RNA提取，建议选用RN002plus Tissue RNA Purification Kit Plus（组织RNA提取试剂盒plus）。

4、怎样操作能得到尽量多的RNA？

答：（1）首先细胞数需要合适，通常6孔板或35mm培养皿，细胞培养至70%以上的密度较好。（2）PBS清洗细胞时，轻柔晃动几下培养皿即可（注意勿吹打，以免丢失细胞），充分吸净PBS后，加入裂解液。如果样品较多，建议每吸去2个孔就加入裂解液，不要让细胞处于没有液体覆盖的情况下超过1分钟，否则细胞极易被晾干导致快速死亡，从而导致RNA大量降解。建议在干净的实验台上操作，不要在有风吹的超净台操作，以免液体蒸发过于迅速。（3）加入裂解液后，吹打10次左右，可以在室温放置1~2分钟，以充分裂解细胞，然后吸到EP管中，vortex，加等体积无水乙醇。（4）洗脱时，可以先将洗脱液预热到65度，然后加入20~30 ul到离心柱的膜中央，室温放置1~2分钟，然后上柱离心。然后可以将液体再次加回到离心柱中，放置5分钟，离心。（5）RNA的产量取决于细胞量，最多能提40 ug。

5、这个试剂盒的基因组DNA是如何去除的？

裂解后，加等体积无水乙醇上柱时，硅胶膜能够相对特异性的吸附RNA，绝大部分DNA和蛋白质等杂质会被离心下去，RNA留在膜上。再用可选步骤中的DNA酶处理，能够进一步去除基因组。如果qPCR引物来自参考文献或设计qPCR引物时采用了跨内含子的设计，则无需DNA酶处理也可，因为目前文献中常用的引物基本都是跨内含子设计的（内含子长度通常较长），在qPCR的条件下，只能检测到cDNA的表达，而不会检测到基因组，因此即使模板中有少量的基因组残留也检测不到，不会对结果产生影响。