欢迎访问上海嘉远生物科技有限公司!

联系我们

  • 上海嘉远生物科技有限公司
  • 400-670-9909
  • 电话:021-54826138
  • 传真:021-34224249
  • 邮箱:tech@jiayuanbio.com
  • 网址:www.jiayuanbio.com
  • 地址:上海市闵行区七莘路1839号明泉财富108广场南楼2603室
您当前的位置:网站首页 >> 技术中心 >> 技术资料技术资料

8分钟RNA快速提取试剂盒---使用注意事项和常见疑问解答

一、使用注意事项:
1、细胞数建议不超过300万,最多不超过500万,否则可能会堵塞离心柱。当细胞数较多时(例如使用6cm dish),裂解后可以先12000g离心1分钟,然后取上清加等体积乙醇,充分混匀后上柱,建议用 6 孔板或 35mm 培养皿培养细胞,细胞密度达到 70%以上较好。
2、为了防止吹打细胞时产生过多的气泡,可以在加入裂解液后,在室温放置 3~5 分钟,使细胞充分裂解,然后吹打 10 下。
3、为了减少裂解过程中气泡的产生,建议吹打时注意以下细节:吹时液体不要完全吹出,枪头里面可以留一点;吸时,液体也不要全部吸完,防止吸进去气泡。
4、吹打充分以后,可以直接将等体积无水乙醇加入孔板中,吹打 10 下,将可能出现的沉淀吹散,然后加入离心柱中,4000g(大约相当于 eppendorf 或 Thermo 离心机的 7000rpm)离心 1min,弃去液体;如果柱子中仍然有液体残留,可以用12000g离心。
5、对于细胞量很少的样品,或者对RNA产量要求较高的情况:
实验开始前可以先把洗脱液放到65度,加入洗脱液后,可以室温放置1~2分钟,使RNA充分溶解,然后离心,然后再将得到的RNA加入柱子中放置5分钟,重复洗脱一次。
6、洗脱液的体积不可太少或太多,建议通常加20~30微升洗脱液即可。
7、 洗脱时,洗脱液一定要加到柱子中央的膜上,不能加到侧壁上,否则会因为 RNA 没有被溶解导致产量大大减少。
8、溶解时建议先放 2 分钟,离心 1 分钟,然后将液体吸出来,加入离心柱中央,再放置 3分钟,使 RNA 充分溶解,然后离心。离心后,RNA 应迅速转移到冰上放置并测浓度,进行后续实验。
9、如果实验对极少量的基因组残留很敏感,可以在4000g离心后,用随试剂盒附赠的DNA酶处理:每个样品的柱子中央加入12 ul稀释好的DNase(DNA 酶可以用 ddH 2 O 稀释,或者用 elution buffer 稀释,然后加入柱中央的膜上,室温放置 5 分钟,然后不要离心,直接加入 wash buffer 后,12000g 离心 1 分钟,洗涤后建议空柱离心一次,以充分去除可能残留的 wash buffer)
二、常见疑问解答
1、这个试剂盒能不能加入裂解液以后先冻存起来,等到样品都收集齐了再一起做?
答:细胞样品可以加入裂解液后,充分混匀,vortex震荡使细胞充分裂解,然后冻存于-80度。理论上能保存的时间跟TRIzol保存的时间相当。具体操作如下:
(1)弃去培养基,加200微升PBS,轻轻摇晃几下培养皿,弃去PBS。
(2)加500ul裂解液到孔板里,吹打10下,放置1分钟,吸出来到1.5毫升EP管里冻存在-80度。可以放置3个月。操作过程中如果样品多,可以分批操作,以免细胞被晾干导致细胞死亡RNA降解。
2、这个试剂盒能提的最小细胞量是多少?
答:常规的细胞(如293T等及常见的细胞,如癌细胞等),最低5万个就可以提出RNA,更少的细胞数需要自己尝试做优化。对于T、B细胞等免疫细胞,由于其体积远小于常规细胞(大约只有常规细胞的几十分之一),因此能提取的最低细胞数需要明显增加,一般建议500万以上,最低也需要100万以上。
3、关于组织RNA的提取,有什么需要注意的吗?
答:本试剂盒提取细胞样品的RNA最简便,提取组织样品时有一定的局限。组织RNA提取,建议选用RN002plus Tissue RNA Purification Kit Plus(组织RNA提取试剂盒plus)。
4、怎样操作能得到尽量多的RNA?
答:(1)首先细胞数需要合适,通常6孔板或35mm培养皿,细胞培养至70%以上的密度较好。(2)PBS清洗细胞时,轻柔晃动几下培养皿即可(注意勿吹打,以免丢失细胞),充分吸净PBS后,加入裂解液。如果样品较多,建议每吸去2个孔就加入裂解液,不要让细胞处于没有液体覆盖的情况下超过1分钟,否则细胞极易被晾干导致快速死亡,从而导致RNA大量降解。建议在干净的实验台上操作,不要在有风吹的超净台操作,以免液体蒸发过于迅速。(3)加入裂解液后,吹打10次左右,可以在室温放置1~2分钟,以充分裂解细胞,然后吸到EP管中,vortex,加等体积无水乙醇。(4)洗脱时,可以先将洗脱液预热到65度,然后加入20~30 ul到离心柱的膜中央,室温放置1~2分钟,然后上柱离心。然后可以将液体再次加回到离心柱中,放置5分钟,离心。(5)RNA的产量取决于细胞量,最多能提40 ug。
5、这个试剂盒的基因组DNA是如何去除的?
裂解后,加等体积无水乙醇上柱时,硅胶膜能够相对特异性的吸附RNA,绝大部分DNA和蛋白质等杂质会被离心下去,RNA留在膜上。再用可选步骤中的DNA酶处理,能够进一步去除基因组。如果qPCR引物来自参考文献或设计qPCR引物时采用了跨内含子的设计,则无需DNA酶处理也可,因为目前文献中常用的引物基本都是跨内含子设计的(内含子长度通常较长),在qPCR的条件下,只能检测到cDNA的表达,而不会检测到基因组,因此即使模板中有少量的基因组残留也检测不到,不会对结果产生影响。