人和小鼠MDSC流式染色方案

小鼠MDSC染色步骤

1、取荷瘤小鼠外周血(50-100 μl)或者脾脏悬液细胞100 μl(1*106)加入Anti-Mouse CD11b FITC 1 μl,Anti-MouseGr1- APC 0.63 μl,Anti-Mouse Ly6G PE 2.5 μl；

2、加入相应的抗体后混匀,建议弹管子,尽量不用枪头直接吹打,室温避光孵育15min,染色过程中再混匀一次；

3、染色完成后加入1ml的红细胞裂解液(1x)裂解 8 min(脾脏悬液若染色前已完成该步骤,可直接进入下一步),裂解过程要混匀细胞,确保充分溶解；

4、300 g/5min离心,弃去上清,弹散细胞；

5、(可选步骤)加入1 ml PBS洗涤一次,300 g/5min离心,弃去上清,弹散细胞；

6、加入500 μl PBS重悬细胞,上机检测。

鉴定结果

Tips：

1、小鼠MDSC分粒细胞样的G-MDSC(CD11b + Ly6C - Ly6G + )和单核细胞样的M-MDSC (CD11b+Ly6C+Ly6G-)。
2、Gr-1抗体可以识别Ly6G和Ly6C,因此只需要染Gr-1和Ly6G即可对MDSC进行分型。
3、本次实验圈CD11b阳性细胞分析Gr-1和Ly6G表达,Gr-1+Ly6G- 细胞即为单核细胞样的MDSC。

人MDSC细胞鉴定结果及抗体

Tips：以上配色方案无需调节补偿,需要三激光仪器检测。若仪器不满足要求,可以将CD14指标换成PE颜 色,该组合方案补偿干扰较小,但是也需要设置单染管调节补偿。

荧光补偿相关问题

荧光补偿：

因流式细胞仪的带通滤光片接收的是一定带宽波长的荧光,故会有干扰光同时被接收,然后一同进入PMT进行光电转换并放大。荧光补偿调节是指在流式细胞多色分析中,校正荧光染料发射光谱之间叠加所造成的误差的过程,即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。

Tips：

在上图中FITC的发射波长是530±30(500~560 nm),PE的发射波长是585±42(543~627 nm),因此在 543~560 nm之间是波长是两个检测通道都可以检测,需要通过设置单染管调节补偿来确定正确的荧光分布。

哪些染料之间有荧光补偿：

1、由同一个激发光激发的荧光染料之间才会涉及补偿,例如：FITC/PE/Percp/PE-Cy5/PE-Cy7。不同激发光激发的两种荧光染料之间几乎没有补偿；例如PE和APC；

2、由同一个激发光激发的荧光染料,如果发射光谱之间有重叠部分则一定有补偿,一般而言发射光谱相邻的两种染料之间会有补偿；

3、注意耦联染料的补偿,像PE-Cy5和APC是由不同的激发光激发,但两者之间补偿太大,不能同时使用,请看如下解释；

Tips:

1、PE-Cy5这种耦联染料其激发过程是蓝光 488nm先激发PE,PE的发射波长575nm 在激发Cy5,最终发射670nm的荧光,而 PE-Cy5在一些条件下会解偶联成PE和Cy5,Cy5可以直接被红光633nm激发,其发射波长也是670nm,这和APC激发过程一样,因此会导致PE-Cy5和APC无法区分。

2、耦联染料是两种染料结合形成的,因此其名称上有两种染料。

3、一般耦联染料在用甲醛固定和热刺激的时候容易解偶联。

1、选择仪器的补偿界面(compensation),选择有补偿的两个检测通道来调节,如果不确定如何调节(两个通道之间互减),可试试两种减法都试试,看是那种减法趋向正确的细胞分布。一般来说漏到哪个通道,哪个通道就是被项,例如FITC漏到了PE,那么就是PE来减去FITC；

2、荧光溢漏的所有染料都需要设置补偿单染管,每个单染管的补偿都要调节。

Tips：

1、调节补偿时,一定要先调节好电压参数,才能调节补偿,补偿调节完成后,电压参数不能改变,若是免调电压的仪器则不必这样。

2、补偿调节完成后,理想的结果是：与阴性群细胞能达到横平竖直的效果,但很多时候调节不到这样的结果,特别是有耦联染料时,其阳性细胞群一般很散,这时候调节的结果要达到不影响圈门分析比例。

3、FITC和PE之间的补偿比较好调节,PE和Percp/PE-Cy5的补偿不好调节,若是新手建议等熟悉补偿调节后再选这样的染料。

4、调节补偿时,要防止调节太过,导致阳性细胞群比例减少(阳性细胞群有部分减到坐标负轴),可以通过看负轴是否有细胞分布来确定(部分仪器可看,像BD CantoII)。