使用IntestiCult™类器官生长培养基（小鼠）进行肠类器官的建立及培养

简介

三维立体（3D）培养系统愈发引人关注，这在很大程度上归功于它有助于 促进多细胞生物机制和精确医学的基础研究，同时可以填补于药物开发 过程中所使用的传统体外高通量筛选和体内研究二者之间的空白^1,2。人 们越来越多地认识到与传统单层细胞培养技术相比，器官型培养可以提 供更具生理相关性的体外模型，这推动了3D培养系统的应用^1,2。在肠上 皮类器官培养系统中，肠干细胞重现了体内成熟肠道中可观察到的自我更 新能力和分化能力（图1）。除了展示成熟肠上皮中存在的所有已知细胞类 型外，肠类器官另一特征是具有隐窝-绒毛结构、上皮极化、和具备功能性 的腔^3,4，这些特点使得该培养系统成为研究肠道生物学的有力工具。肠类 器官在再生医学研究方面同样具备潜力，已经有研究发现类器官可以融入 到化学性损伤小鼠的结肠中形成结肠段，且在形态上与周围上皮细胞没有 区别⁵。肠类器官已成功与细菌和免疫细胞共培养，为研究上皮组织与免 疫系统的细胞间的相互作用提供了模型^6，7。同时，可以使用CRISPR-Cas系 统或逆转录病毒和慢病毒的感染对小鼠肠类器官进行基因操纵^8,9。

本技术公告逐步阐述了如何使用IntestiCult™类器官生长培养基（小鼠） 和Corning®Matrigel®基质进行小鼠小肠和结肠隐窝的分离、培养、传代 和冷冻保存。

图1. 光学显微镜（10X）下培养5天的小鼠小肠类器官。

操作流程

第一部分：分离小鼠肠隐窝

在分离隐窝的当天，从冰箱中取出一瓶IntestiCult™基础培养 基，置于室温环境使其恢复至室温（15 – 25℃）。从冰箱中取出 IntestiCult™添加物1和添加物2，并置于室温（15 – 25℃）下解冻。 用移液器充分混合添加物1和2。

注意： 解冻后须立即使用。

2.将5mL添加物1和5mL添加物2加入至基础培养基中制备完全培养 基。盖紧盖子，翻转几次混合均匀。

3.使用前必须将培养基恢复至室温（15 – 25℃）。根据该方案培养从 小鼠小肠或结肠分离的隐窝，需要使用12mL完全培养基以满足在 12个单独的培养孔中进行类器官培养（共3个接种密度，每个接种 密度接种4个孔）。

4.在准备进行培养前，将所需的抗生素加入完全的IntestiCult™类器 官生长培养基中。我们建议使用50μg/mL庆大霉素（gentamicin）或 100单位/100μg/mL的青霉素/链霉素（penicillin/streptomycin）。

IntestiCult™类器官生长培养基的分装和储存

完全培养基可在2 – 8℃下储存长达两周。为避免反复冻融，将 完全培养基以适当体积分装，分装后的培养基在-20℃下冷冻储 存最多三个月，切忌反复冻融。

5.制备此流程所需的其他培养基和试剂。在冰上解冻500μLCorning®Matrigel®基质。 我们推荐Corning® Matrigel®减生长 因子（GFR）基底膜基质，无酚红（Corning® 产品号# 356231）。 在冰上放置500mL不含镁和钙的PBS（产品号# 37350）、100mL 添加有0.1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS、25mL含有15mM HEPES的DMEM / F-12（产品号# 36254）。将温和细胞解离试剂 （GCDR，产品号# 07174）置于室温（15 – 25℃）。将经组织培养 （TC）处理的24孔培养板（Corning® 产品号# 3526）在37℃的 培养箱中预热至少30分钟。

注意： 为确保类器官培养过程中建构理想的Matrigel®凝固液滴 （dome），请使用经组织培养（TC）处理的培养板。

6.将小鼠处死后，在靠近胃的一端取长度约20厘米的小肠。使用尖 头镊子去除肠道外部的膜、血管和脂肪（图2）。将肠段放入一个 10 cm培养皿中，里面含有5mL冷的（2 – 8℃）PBS。

结肠样本：可以使用以下操作流程从一只小鼠中分离样本。但是， 由于不同新手用户之间操作差异性较大，建议使用来自两只或 三只小鼠的结肠组织以确保在第一次操作时以更高的密度进行 接种。

处死小鼠并从每只小鼠体内取3 – 6厘米的结肠。请确保切口位于 盲肠下方几毫米，和直肠上方几毫米，以防止过量毒素和废物进 入培养物。请注意，近端结肠的干细胞密度最大，因此切除直肠 附近更多组织不会显着增加隐窝的数量。

图2. 小鼠肠道的分离

A）去除小鼠肠道上的外膜和脂肪 B）去除外膜后的小鼠肠片段。

7.通过将1mL移液器枪头从肠道一端的开口处插入，用1mL冷的 （2 – 8℃）PBS轻轻冲洗肠段。

8.使用小剪刀，将肠段纵向切开（图3A），肠腔朝上打开。使用微 量移液管用1mL冷的（2 – 8℃）PBS轻轻洗涤肠道片段三次（图 3B）。

图3. 小鼠肠片段制备步骤

（A）切开肠段（B）用1mL冷的PBS洗涤肠段。

注意：将移液管和移液枪头提前润湿

在整个操作过程中，都需要在操作肠道片段或隐窝之前预 先润湿移液管和移液枪头，以防止组织粘在移液管或枪 头上。

注意：注意离心速度

在整个操作过程中，离心速度通常设定为200 x g和290 x g。

9.将肠段转移到一个10cm培养皿中，里面含有15mL新鲜的冷 （2 – 8℃）PBS。使用镊子夹住肠段在干净的缓冲液彻底清洗。

10.将15mL冷的（2 – 8℃）PBS加入一个50mL锥形管中。用镊子夹住 经过清洗的肠道一端，并悬在管口上。从肠道底部开始，用剪刀 将肠切成2毫米的小段，让这些片段落入管内的缓冲液中。

11.用PBS预先润湿10mL移液管，并用它轻轻地上下吹打肠道片段 三次。

12.让片段通过重力沉降（约30秒；图4A），然后轻轻吸出上清液， 留下足够的液体，使液面刚刚没过组织片段（图4B）。

13.加入15mL新鲜的冷（2 – 8°C）PBS，使用预先润湿的10mL移液 管重复吹打清洗步骤，上下吹打悬浮的组织片段三次。

14.使用同一支移液管，将步骤12 – 13再重复15至20次，或直至上清 液澄清（图4C）。

结肠样本： 与小肠不同，在分离结肠隐窝时，通常在用冷的 （2 – 8℃）PBS洗涤三到五次后，上清液就会变得清澈。尽管如 此，结肠片段还是要用冷的PBS洗涤15次，然后再进行下一步。

15.除去上清液，将组织片段重悬于25mL室温的（15 – 25℃）GCDR 中，并在室温（15 – 25℃）下置于摇床上以20rpm转速孵育15分 钟。

结肠样本： 将孵育时间延长至20分钟。

16.让组织片段通过重力沉降约30秒。小心吸出并丢弃上清液，留下 足够的液体以没过组织片段。

17.将组织片段重悬于10mL含有0.1％ BSA的冷（2 – 8℃）PBS中，并 用移液管上下吹打三次。静置直到大部分肠组织片段沉降到底部 （约30秒）。

18.使用同一支移液管，小心地移除上清液并使用70μm滤网过滤， 将滤液收集于干净的50mL锥形管中。丢弃滤网并将滤液标记为“ 馏分1”。将馏分置于冰上。

19.重复步骤17 – 18三次，以获得馏分2 – 4。

结肠样本： ：由于小鼠结肠中残留的碎屑和废物，可能需要额外一 到两个馏分。首先获得前四个馏分，然后从四个馏分中分别吸取 1mL至6孔板中的孔中，并在明视野显微镜下用4倍镜观察。如果 馏分3和4具有高比例的薄纤维物体，则重复步骤17 – 18以产生 馏分5和6。如果馏分3和4看起来较干净，则可直接继续 步骤20。

20.在2 – 8℃下将馏分以290 x g离心5分钟。小心地倒出并丢弃上 清液，将沉淀保留在每个管中。

21.将各试管中的沉淀重悬于10mL含有0.1％ BSA的冷（2-8℃）PBS 缓冲液中。将各试管的悬液分别转移到干净的15mL锥形管中，并 标记对应的馏分序号。

22.将四个馏分在2 – 8℃下以200 x g离心3分钟。轻轻倒出上清液。将肠隐窝沉淀留在管中。

图4. 小鼠肠片段洗涤步骤

（A）肠片段沉降于管底; （B）吸出上清液后的肠碎片; （C）第一次（左）和第二十次 （右）洗涤后的上清液。

第二部分：从分离的小鼠肠隐窝进行类器官培养

1.将隐窝样本重悬于10mL冷的（2 – 8℃）DMEM/F-12中。

2.从各个馏分分别吸取1mL加入6孔板的各个孔中并做好标记，并 使用倒置显微镜检查馏分的质量（6孔板中的样本可在镜检后加 回到其各自对应的馏分中）。选择一个或两个富含肠道隐窝的馏 分，以进行类器官培养。适合进行后续培养的隐窝具有不同大小 尺寸，通常为矩形或圆形，并具有相对光滑的边缘，其外观类似于 单层上皮的小的折叠部分（图5A和5B）。具有较高比例的绒毛、 单细胞、碎屑的馏分不适合于类器官培养。通常情况下，馏分3和 4通常富集有较多的适合后续培养的隐窝。

3.预先润湿移液枪头，从所选的馏分中取出10μL置于玻璃载玻片 或血细胞计数器上。使用倒置显微镜，计数10μL样本中的隐窝数 量（图5C）。不要计算单个细胞或大的多层组织碎片。将计算出 的隐窝数乘以100，此为馏分中每毫升的隐窝数。

4.计算含有大约500、1500、3000个隐窝的所选馏分的体积。将所 需体积分别转移至三个做相应标记的15mL锥形管中，并以200 x g和2 – 8℃离心5分钟。小心吸出并弃去上清液。

5.将150μL于室温（15 – 25℃）的完全IntestiCult™器官生长培养基 加入每个试管中。不要使用冷的培养基。

示例：馏分体积计算

每10μL样本中所含的隐窝数量：15个

15×100=每毫升馏分约含1500个隐窝

计算步骤4中所需馏分的体积：

500个隐窝需要0.33mL馏分

1500个隐窝需要1.0mL馏分

3000个隐窝需要2.0mL馏分

图5. 在培养前检查评估分离的肠隐窝馏分

光学显微镜下观察到的肠隐窝馏分（1mL馏分，置于6孔板中的一个孔），其中（A） 馏分2，放大2倍；（B）将馏分3和4混合，放大10倍；（C）适用于类器官培养的肠隐 窝馏分（取10μL置于血细胞计数器上）。以绿色圈出的肠隐窝适合类器官培养，计数 时应被计入，以确定馏分中隐窝数量。红色圈出的为不适合类器官培养的绒毛、组织 碎片、或碎屑。

6.将150μL未经稀释的Matrigel®基质加入至每管中。使用相同的 移液枪头，小心地上下吸打十次以重悬沉淀。注意避免产生 气泡。

7.从含有500个隐窝的悬液中吸取50μL，并加入到提前预热的24 孔板其中四个孔中的中心部位。为了防止接种时出现气泡，在使 用移液枪时指压到第一段（不要按到底部）。样品应在每个孔的 中心形成凝固液滴（domes，图6）。将以上操作步骤分别应用于 1500个隐窝和3000个隐窝的悬液，最终共接种12个孔。

注意： 快速操作以上步骤，因为Matrigel®容易凝固。

图6. Matrigel® domes

肠隐窝悬浮于Matrigel®Matrix和IntestiCult™类器官生长培养基的1：1混合物中形 成图中所示dome。图片从（A）上面和（B）侧面拍摄。

8.将培养板在37℃下静置10分钟以待Matrigel®完全凝固。将培养 板放入培养箱时，应注意不要打扰或破坏dome。

9.使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入750μL于室温 （15 – 25℃）的完全IntestiCult™类器官生长培养基。不要将培 养基直接加到dome上。

10.将无菌PBS加至其它未接种液滴的孔中，以保持培养时的湿度。

11.将培养板的盖子盖上，并在37℃和5％ CO2下进行培养。

12.观测类器官生长情况。通常，隐窝开始培养约3小时后形成球状 结构（图7A）。通常在培养2至4天后，小肠类器官开始萌芽（图 7B），并且在第5至7天形成复杂的多叶结构（图7C）。

结肠样本： 与小鼠小肠隐窝培养系统不同，源于结肠隐窝的类器 官生长较慢。培养第二天时，开始出现小的囊性类器官（图7D）， 并且在第3天至第7天之间逐渐长大（图7E）。在第7天和第10天 之间，结肠类器官可形成萌芽结构，但是和小肠的类器官相比， 其结构不太明显（图7F）。

13.每周进行三次完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘，小心 地将原有液体培养基吸出，并加入750μL新鲜的于室温 （15 – 25℃）预热的完全IntestiCult™类器官生长培养基。

14.在培养第7至10天以1：6的比例进行类器官传代，以避免类器官 过度生长和在空腔内积累过量的碎屑。参考第3部分的传代步 骤。

结肠样本： 在培养第7至10天，或密度达到每孔150个类器官时， 以1：2的比例进行类器官传代。

图7. 经接种和培养后小肠和结肠类器官生长的时间轴。

在1：1的Matrigel® 基质和IntestiCult™生长培养基所形成的dome中培养的小肠隐窝，于37℃和5%CO2条件下培养后的（A）第1天、（B）第5天和（C）第7天的光学显微镜图像。 在类似培养条件下，结肠隐窝于（D）第1天、（E）第3天和（F）第7天后的光学显微镜图像。

第三部分：传代小鼠肠类器官

1.在传代当天，从冰箱中取出预先制备好的IntestiCult™器官生长 培养基，恢复至室温（15 – 25℃）。培养基在使用前必须恢复至 室温，每孔需要4mL完全培养基传代。配制完全培养基，请参阅 本第一部分的第1步和第2步。

2.培养基完全解冻后，加入适量的抗生素。我们推荐使用50μg/mL 庆大霉素或100单位/100μg/mL的青霉素/链霉素双抗。

3.准备过程中所需的其他培养基，缓冲液和试剂。每孔需要150μL Matrigel®基质（Corning® 货号# 356231），在冰上解冻。将温 和细胞解离试剂（产品号# 07174）和每孔所需要的10mL含有 15mM HEPES的DMEM/F-12（货号# 36254）置于冰上。将所需 数量的TC处理的24孔培养板（Corning® 货号# 3526）置于37℃ 孵箱预热30分钟。

4.在每个需要传代的类器官的孔中，小心吸出其中的培养基，不要破坏Matrigel® dome。

5.每孔加入1mL温和细胞解离试剂（GCDR，货号# 07174），室温 （15 – 25℃）孵育1分钟。

6.使用GCDR预先湿润1mL的枪头，上下吹打20次，吹散凝固的 dome。

7.使用同一个枪头，将培养物转移到15mL的离心管中。之后使用 1mL新鲜的GCDR润洗该培养孔，一并转移至15mL的离心管中。

8.其余需要传代的培养孔，重复第6步和第7步。

9.在转速为20rpm的摇床上室温（15 – 25℃）将以上15mL的离心 管孵育10分钟。

10.以290 x g，2 – 8℃下离心5分钟，小心去除上清液。

11.使用预先湿润的10mL的移液管将细胞沉淀重悬于10mL （2 – 8°C）冷的DMEM/F-12中，再以200 x g，2 – 8℃离心5分 钟，小心吸出上清的DMEM/F-12，不要接触到细胞沉淀。

12.每管加入150μL室温的IntestiCult™类器官生长培养基。加入 150μL未稀释的Matrigel®基质后，上下吹打十次，重悬细胞沉 淀。尽量避免产生气泡。

13.从每个离心管，使用移液枪头吸取50μL培养基/Matrigel®混合悬 液，加至预热的24孔培养板其中一可孔的中心，以形成dome。

14.将培养板的盖子盖好，在37℃下静置10分钟以待Matrigel®完全 凝固。

15.使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入750μL预热至室温 （15 – 25℃）的完全IntestiCult™类器官生长培养基。不要将培 养基从dome上直接加入。

16.将无菌PBS加至其它未接种dome的孔中。

17.将培养板的盖子盖好，并在37℃和5％ CO2下进行培养。

18.每周进行三次完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘，小 心地将原有液体培养基吸出，并加入750μL新鲜的于室温（15 – 25℃）的完全IntestiCult™类器官生长培养基。

使用此系统，类器官可被无限传代。

第四部分：冻存小鼠肠类器官

本操作流程适用于每管冻存和复苏200个类器官。为达到最佳的结 果，冻存应在类器官成熟后进行。

注意：肠类器官从原代建立后，至少应进行两次传代后才适宜进行冻 存；为达到最佳效果，应使用成熟的并具有多芽的类器官。从小肠培 养出的类器官通常在培养5 – 7天后达到成熟（图8A）。结肠类器官的 成熟更加缓慢，萌芽也比较不明显，通常在培养7 – 10天到达成熟（ 图8B）。

1.准备本操作流程中所需的所有培养基和试剂。将不含钙和镁离子 的PBS（产品号# 37350），含15mM HEPES的DMEM/F-12（产品 号# 36524）和CryoStor® CS10（产品号# 07930）置于冰上。将 需要进行类器官冻存的培养板取出。

2.使用倒置显微镜，对每孔的成熟类器官进行计数。为保证每管中 含有200个类器官，可将几孔的培养物合并冻存。

3.吸出培养孔中的IntestiCult™类器官生长培养基。加入1mL冷的 （2 – 8℃）PBS。

4.使用PBS预先湿润1mL的枪头，上下吹打10 – 20次吹散Matrigel® 基质。将含有200个类器官的混合物转移至1个15mL的离心管，如 需要可合并几个培养孔。

5.使用预先湿润的1mL的枪头，将1mL冷的（2 – 8℃）PBS加入每孔 进行清洗，上下吹打5次，转移至第4步的离心管中。

6.以290 x g，2 – 8℃离心5分钟。小心去除上清液，不要接触到沉 淀的类器官。

7.使用7 – 10mL冰冷的含有15mM HEPES的DMEM/F-12重悬类器 官沉淀。轻柔的敲打离心管，或者使用枪头轻柔的吹打，吹散沉 淀。再以200 x g，2 – 8℃离心5分钟，小心去除上清液。

8.使用1mL冰冷的（2 – 8℃）CryoStor® CS10重悬类器官沉淀，每 管冻存200个类器官。

9.使用同一个枪头，将含有类器官的CryoStor® CS10转移至预先标 记好的冻存管中。将冻存管放入具有500mL异丙醇的细胞冻存 盒或不含IPA的冻存盒。

10.将细胞冻存盒置于-80℃冰箱24小时后，将细胞冻存管转移至液 氮（-135℃）中进行长期的储存。肠类器官可在-135℃下冻存6个 月。不建议在-80℃进行长期储存。

注意： 操作迅速，尽量缩短未冻存的类器官与CryoStor® CS10的 接触时间。

图8. 光学显微镜10X物镜下的成熟肠类器官

类器官在1：1 Matrigel®基质和IntestiCult™生长培养基所形成的dome中进行培养 培养条件为37℃和5% CO2。（A）培养5天后的小肠类器官和（B）培养10天后的结 肠类器官。

第五部分：复苏小鼠肠类器官

1.冰上解冻120μL Matrigel®基质（Corning® 货号 #356231），将 预先配置好的完全IntestiCult™类器官生长培养基预热至室温 （15 – 25℃）。24孔板的4个培养孔需要3.1mL完全培养基。配制 完全培养基，请参阅本第一部分的第1步和第2步。将所需的TC处 理的24孔培养板（Corning® 货号 ＃3526）置于37℃孵箱预热 30分钟。

2.将2mL的25% BSA母液与48mL含有15mM HEPES的DMEM/F-12 （产品号# 36254）混合于一只50mL的离心管中，用于配置含有 1% BSA的DMEM/F-12清洗液。操作过程中，室温（15 – 25℃）保 存。本清洗液可于2 – 8℃保存6个月。

3.将2mL含有1% BSA的DMEM/F-12加至一个15mL离心管中，放于 室温（15 – 25℃）。

注意： 为避免影响细胞活率，细胞应当马上转移至该离心管中。

4.拿出冻存的类器官，置于37℃水浴中。当冻存液变为液体，解冻 即完全，此时应在管底观测到类器官。在37℃解冻大概需要 2 – 2.5分钟，培养物过热会影响类器官的复苏效率。

5.打开前，使用70%酒精或异丙醇擦拭冻存管外部。使用1mL枪头 将1mL含有1% BSA的DMEM/F-12直接加入管中。上下吹打4次， 将冻存管中的内容物混匀。立即使用预先湿润的1mL枪头将冻存 管中的内容物转移至第3步的离心管中，即含有2mL 1% BSA的 DMEM/F-12。

6.用1mL含有1％ BSA的DMEM/F-12将细胞冻存管清洗两次，然后 转移到离心管中。务必清洗到细胞冻存管的整个内表面区域，包 括盖子内部。

7.以200 x g，2 – 8°C离心5分钟，去除CryoStor® CS10。小心去除 上清液。避免产生气泡。如果离心后存在气泡，则在吸出上清液 体之前，先小心地吸去气泡。

8.使用200μL枪头，加入100μL室温（15 – 25℃）的完全 IntestiCult™器官生长培养基重悬类器官。

9.使用200μL枪头加入100μL Matrigel®。上下吹打5 – 10次，混匀 培养物，以确保整个样品的密度和粘度一致。避免产生气泡。

10.U使用预先湿润的200μL枪头，吸取50μL，并加入到提前预热的24 孔板其中四个孔中的中心部位。为了防止接种时出现气泡，在使 用移液枪时指压到第一段（不要按到底部）。于37℃，5％ CO2下 孵育10分钟，使Matrigel®固化。

11.使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入750μL预热至室温 （15 – 25℃）的完全IntestiCult™类器官生长培养基。不要将培 养基从dome上直接加入。

12.将无菌PBS加至其它未接种dome的孔中。

13.将培养板的盖子盖好，并在37℃和5％ CO2下进行培养。每周进 行三次完全换液。

14.为了获得最佳结果，解冻后应对冻存的类器官进行两次传代。冷 冻后，类器官生长变慢。类器官通常在传代后5 – 10天进行传代 （图9）。通常类器官的生长速度应在一次传代后恢复（图9）。

注意： 不建议将类器官暴露于连续复苏 – 冻存的循环中。

图9. 从冻存的类器官生成的肠类器官的光学显微镜成像

复苏的类器官在1：1 的Matrigel®基质和IntestiCult™类器官生长培养基所形成的 dome中进行培养，培养条件为37℃和5% CO2。（A）第0代，培养后第5天；（B）第1 代，培养后第6天。

IntestiCult™ 常见问题

IntestiCult™类器官生长培养基可以在37°C水浴中，而不是在室温（15 – 25°C）下解冻吗？

分装好的IntestiCult™类器官生长培养基在使用前可使用37℃水浴解 冻，但我们不建议重新冷冻使用此方法解冻的培养基。

为什么隐窝的分离需要使用冰冷的DMEM/F-12，并在4°C下进行？

隐窝分离在4℃进行，会最大限度的降低对隐窝的损伤。

切割的小肠片段可以大于2 mm吗？大小的范围是多少？

使用2mm的肠段在本操作流程中可进行有效的清洗和隐窝的分离。 较大的肠段可能需要更多次数的冲洗，且导致较低的隐窝回收率。

可以对肠段使用离心而非重力沉降吗？如果可以，应使用多大的速度离心？

我们建议使用重力沉降，由于离心会导致有毒物质的沉降，降低隐窝分离效率和回收率。

进行肠隐窝计数时，为什么多层的组织片段不应被计算？如果它们不是聚集的隐窝，那会是什么呢？

大块的、多层的组织片段很有可能是组织碎片，在肠隐窝分离过程中 未被去除。这些片段通常不具有干细胞，所以不会发育成为类器官。这 些片段通常会在早期的隐窝组分中出现，使用后面的组分会消除大部 分这些多层组织结构的困扰。

在进行小鼠小肠隐窝分离时的第5步为什么不能使用冷 的IntestiCult™培养基？如果不小心使用了冷的培养基 该怎么办？

由于冷的培养基会融化基质，所以必须使用室温培养基混合肠隐窝 和Matrigel®基质。如果不小心使用了未预热到室温的培养基，等待混 合物预热至室温后再在预热的24孔板上进行接种domes。注意一旦 培养基和Matrigel®基质一旦混合，它们开始凝固，所以动作需要快速 于。4个培养孔的接种时间应在30 – 60秒内完成。如果培养孔还不能 进行接种，将混合物短暂置于冰上会再度降低黏度。

在第三部分：传代小鼠肠类器官的操作流程中的第11 步，如果使用了预热的DMEM/F-12怎么办？

我们推荐使用冷的DMEM/F-12去清洗解离后的类器官沉淀。使用预 热的培养基会导致细胞在清洗过程中损伤，降低回收率。

如果每孔中接种的类器官密度高于或低于推荐的200 个类器官每孔，怎么办？

相邻生长的类器官的生长情况会比较好，但是接种密度太高会造成培 养物压力过大。我们不建议每孔的接种密度超过200个类器官，但有 证据显示，即使在每孔接种400个类器官的情况下，培养物会在两代 内恢复（图10）。类器官接种密度过稀亦可在一次传代后恢复。

如果类器官在冻存前/后破碎了，类器官是否会恢复？

只要培养物中具有健康或单个的肠干细胞，已经破碎的类器官可以在 一代后恢复（图11）。这些类器官通常需要额外3 – 5天重新构建，且需 要进行数次传代后才能生成足够数量的类器官。

图10. 从冻存的类器官进行肠类器官培养，接种密度过高的状态

400个冻存的类器官复苏后接种到一个50μL的1：1的Matrigel®基质和IntestiCult™ 类器官生长培养基所形成的dome，培养条件为37℃和5% CO2下。（A）第0代，培养 第5天和（B）第1代，培养第6天。

图11. 从已经破碎的冻存类器官或冻存后破碎的类器官中生成的肠类器 官的光学显微镜成像

类器官培养于1：1的Matrigel®基质和IntestiCult™类器官生长培养基所形成的 domes，培养条件为于37℃和5% CO2。（A）第0代，培养第5天和（B）第1代，培养 第6天。

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参考文献

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