人和小鼠Th亚群鉴定方案

胞内因子染色操作流程

Tips：采集外周血的抗凝管必须是肝素抗凝管,刺激剂尽量选用冻干粉自己配置；cocktail刺激剂是液体形式,PMA会因保存不当导致活性降低,影响刺激效果,而冻干粉形式的PMA较稳定,可以保证刺激效果。若检测的细胞因子种类较多,需要分开染色,可以取400 μl外周血刺激。

小鼠脾脏Th亚群鉴定

刺激剂配方：

1) PMA (Cat# 1652981)

贮存液：PMA 溶于DMSO(二甲基亚砜),浓度为0.1 mg/ml,-20℃分装保存

工作液：贮存液1:4 稀释于培养基(不含血清)或PBS(无菌,无NaN3)中,此时为25 μg/ml

工作浓度：25 ng/ml (工作液稀释1000x)

2) Ionomycin

贮存液：Ionomycin 溶于DMSO,浓度为1 mg/ml,-20 ℃分装保存

工作浓度：1 μg/ml (贮存液稀释1000x)

3) BFA

贮存液：BFA 溶于DMSO,浓度为5 mg/ml,-20 ℃分装保存

工作浓度：10 μg/ml ( 贮存液稀释500x )

细胞刺激：(刺激体系1ml）

1、无菌取小鼠脾脏,研磨制备单细胞悬液；离心,弃去上清,吹散沉淀,加入5ml红细胞裂解液(Cat.No: 64010-00-100),室温放置5~8分钟；加入10 ml完全培养基终止反应,离心,弃去上清；吹散沉淀,加入10ml 培养基,过筛网后离心,弃去上清；吹散沉淀,加入适量完全培养基重悬,计数,重悬到2x106/ml；2、细胞接种到24孔细胞培养板,每孔1 ml,再加入1 μl PMA( 25 μg/ml )、1 μl Ionomycin( 1 mg/ml ),轻轻吹打混匀细胞。放入 CO2培养箱培养刺激0.5 h后,每孔再加入2 μl Brefeldin A( 5 mg/ml ),轻轻吹打混匀细胞,放入CO2培养箱培养继续刺激3.5 h。留一孔不加BFA用做质控。

流式检测：

1、质控检测(选做)：收质控孔细胞于离心管内,离心弃去上清后重悬于100 μl PBS中,加入 CD3和CD69流式抗体,室温避光孵育15 min,加入1 ml PBS, 500 g/8 min离心,枪头吸去上清,弹散管底沉淀,重悬到一定体积上机检测,若CD3阳性细胞CD69表达超过 90%,则继续以下步骤；

2、收集其他孔内细胞于流式管内,500 g/8min离心,枪头吸去上清,弹散管底沉淀,加入相应的表面染色抗体(CD3\CD8),弹散混匀。室温避光孵育15 min后,500 g/8min离心,枪头吸去上清；

3、弹散管底沉淀,加入1 ml的固定/破膜工作液,(1 ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3 ml Fixation/Permea- bilization Diluent稀释 ),涡旋混匀,现配现用；

4、室温避光孵育30 min,600 g/10min离心,在吸水纸上倒扣流式管弃去上清(此时细胞已在管底形成很牢固的沉淀,不容易丢失),弹散管底沉淀；

5、加入1 ml Permeabilization Buffer(此为10x,须与蒸馏水1：10稀释成工作液)工作液离心洗涤细胞,破膜15min(室温避光),600 g/10min,在吸水纸上倒扣流式管弃去上清,弹散管底沉淀；

6、加入100 μl Permeabilization Buffer (1x),同时加入相应的细胞因子染色抗体,室温避光孵育15 min ；

7、加1ml Permeabilization Buffer(1x),600 g / 8min；在吸水纸上倒扣流式管弃去上清；弹散管底沉淀；

8、加入适量体积(建议300~500 μl)的PBS重悬细胞,上机检测并分析。

小鼠脾脏Th亚群鉴定所需抗体及辅助试剂

小鼠脾脏Th亚群鉴定结果

Tips：
1、胞内染色操作过程时间长,需要的试剂比较多,特别是细胞刺激过程很重要,传统的刺激是加入 PMA/Ionomycin/BFA/Monensin的混合液(Cocktail),其中BFA和Monensin起破坏高尔基体作用, 对细胞具有毒性,因此该刺激方案不能达到最优刺激效果,而我们改进后的方案是先用PMA和 Ionomycin刺激0.5 h,让细胞有一个刺激的反应过程,再加入BFA抑制,一定程度上避免了对细胞的毒性,该刺激方案能更有效的刺激细胞产生细胞因子。
2、为了实验的严谨性,确保实验能出结果,建议做阳性质控,以验证细胞已经活化,PMA刺激T细胞 3.5 h后,细胞表面会表达CD69,因此细胞活化的要求是90%以上T细胞表达CD69,若是用Cocktail刺激则没法做质控(BFA会抑制CD69表达)。
3、PMA小分子极不稳定,温度的改变对其刺激效果影响很大,所以PMA一定要分装冻存,避免反复 冻融,而Cocktail里面PMA在长途运输中活性很难得到保证。

人外周血Th亚群鉴定方案

细胞刺激：(刺激体系1ml)

取人外周血(肝素抗凝)200 μl加入24孔板内,加入800 μl的完全培养基,再加入1 μl PMA(25 μg/ml)、1 μl Ionomy-cin (1 mg/ml ),轻轻吹打混匀细胞。放入 CO2培养箱培养刺激0.5 h后,每孔再加入2 μl Brefeldin A(5 mg/ml),轻轻吹打混匀细胞,放入CO2培养箱培养刺激3.5 h。

流式检测：

1、收集细胞于流式管内,500 g/8 min离心,枪头吸去上清,弹散管底沉淀,加入相应的表面染色抗体(CD3\CD8),弹散混匀。室温避光孵育15 min后,500 g /8 min离心,枪头吸去上清；

2、弹散管底沉淀,加入1 ml的固定/破膜工作液,(1 ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixa-tion/Permeabilization Diluent稀释),涡旋混匀,现配现用；

3、室温避光孵育30 min,600 g/10min离心,在吸水纸上倒扣流式管弃去上清(此时细胞已在管底形成很牢固的沉淀,不容易丢失),弹散管底沉淀；

4、加入1 ml Permeabilization Buffer(此为10x,须与蒸馏水1：10稀释成工作液)工作液离心洗涤细胞,破膜15min(室温避光),600 g/10min,在吸水纸上倒扣流式管弃去上清,弹散管底沉淀；

5、加入100μl Permeabilization Buffer(1x),同时加入相应的细胞因子染色抗体,室温避光孵育15 min；

6、加1ml Permeabilization Buffer(1x),600 g/ 8min,在吸水纸上倒扣流式管弃去上清,弹散管底沉淀；

7、加入适量体积(建议300~500 μl)的PBS重悬细胞,上机检测并分析。

Tips：
1、根据实验需求选择相应的抗体,并做单染管用于调节补偿(具体如何设置单染管,可参照后文中补偿章节的介绍)。
2、尽量做同型对照,因细胞因子表达量不高(尤其是IL-4表达量非常低),细胞因子抗体对应的同型对照一般都要做。
3、PMA刺激会导致人T细胞表面CD4表达的下调,PMA与Ionomycin联合刺激下调非常明显,4h刺激 后会下调50%以上,6h刺激几乎检测不到CD4,因此我们的界定CD4+T细胞是通过染CD3和CD8, 来圈CD3+CD8- 的细胞。
4、PMA对小鼠T细胞CD4表达影响很小,因此可以直接染CD4来圈门。

5、因破膜剂对细胞损伤较大,建议离心后形成的细胞沉淀先弹散形成细胞悬液,再加入破膜剂,这样会减少对细胞的损伤(形成的细胞碎片较少)。

人Th亚群鉴定所需抗体及辅助试剂

Tips：以上配色方案适合配备有三种激光器的流式细胞仪(蓝激光/红激光/紫激光),该配色方案可以同时检测三 种细胞因子,且补偿很好调节,若仪器不支持该配色方案,可联系PeproTech索取其他配色方案。

人外周血Th亚群鉴定结果