如何在大量扩增T细胞的同时，维持其表型和功能？

T细胞治疗是一个快速增长的研究领域。若想最大化激发患者来源的T细胞的治疗潜能，对大规模制造T细胞的方案进行优化是非常重要的。

在本篇技术公告中，我们阐明了细胞密度对T细胞扩增的重要性。我们的研究结果表明，将T细胞维持在较低的密度可以改善T细胞的生长和活率，特别是在细胞扩增的早期阶段。

图1. T细胞分离、活化和扩增流程

结果

早期细胞稀释对人T细胞扩增的影响

为了研究细胞密度对人T细胞扩增的影响，我们使用ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂或ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂在第0天激活T细胞。在第3天，我们将总培养体积扩大2倍、4倍、8倍、16倍或32倍，并确定不同培养体积对细胞总扩增量的影响。其中，在扩大4倍和8倍培养体积条件下的细胞扩增量和细胞活率最高，并且经扩增细胞的活化表型没有显著变化（图2）。

图2. T细胞活化后3天，培养方案对细胞总扩增量的影响
（A）在第10天，于扩大4倍和8倍的培养体积中可观察到最佳的活T细胞扩增率。4倍和8倍培养体积中的细胞分别扩增了176倍和222倍。（B）CD4+和（C）CD8+ T细胞亚群在活化标志物表达（CD25和PD-1）方面存在细微差异，且与第3天的扩增倍数和传代培养方案无相关性（数据来自一个具有代表性的供体）。

T细胞激活剂的对比

推荐的人T细胞扩增流程

根据上述实验结果，我们可以通过改变细胞稀释浓度来优化人T细胞扩增流程（图3C）。最佳细胞稀释浓度为在细胞活化后的第3天，将培养体积扩大8倍，或将细胞密度维持在1-2.5×10^5个/mL。我们在细胞活化后的第5和第7天，分别将培养体积继续扩大4倍以进一步稀释扩增的细胞。

图3. 优化培养流程中不同ImmunoCult™人T细胞激活剂的对比

在第0天时，向添加有rhIL-2的ImmunoCult™-XF T细胞扩增培养基中添加ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂或ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂以激活T细胞。在T细胞活化后第3天，通过加入新鲜培养基使培养体积扩大4倍或8倍。在第5天和第7天时，分别将培养体积继续扩大4倍。根据初始细胞接种数，分析在培养期间的累积倍数扩增及在第10天的总扩增倍数。（A）添加ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂时，在细胞激活第3天将培养体积扩大8倍可促进细胞生长，总扩增倍数为405±174（平均值±SD，n=14）。细胞激活第3天将培养体积增加4倍，总扩增倍数为240±90（* p<0.0001，配对t检验）。（B）添加ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂时，将培养体积增加8倍或4倍，最终的扩增倍数分别为150±95和186±165（平均值±SD，n=14）（ns表示无显着差异，配对t检验）。（C）推荐的T细胞扩增步骤及ImmunoCult™试剂。

使用Xuri™细胞扩增系统进行人T细胞扩增

图4. 使用Xuri™细胞扩增系统W25扩增T细胞早期对细胞进行稀释同样可以优化T细胞扩增数量
将纯化的T细胞以1×10^6个/mL的浓度接种在培养瓶中并加入ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂。在第3天时，加入新鲜培养基将培养体积扩大2倍、4倍、8倍。在第5天时，将细胞转移到Xuri™ Cellbag™生物反应器。如图1所示，在第8天开始灌注新鲜培养基。培养11天后，在扩大8倍培养体积的条件下，观察到最大扩增倍数（263倍）。不同稀释倍数的细胞活率相似。

扩增的T细胞的表型

除细胞数外，T细胞表型在细胞治疗的功效中起到至关重要的作用。

图5. 使用ImmunoCult™试剂进行活化和扩增后，大部分扩增的T细胞具有中枢记忆性T细胞表型（CD62L+ CD45RO+）

在第0天使用ImmunoCult™人T细胞激活剂刺激纯化的T细胞，并在补充有rhIL-2的ImmunoCult™-XF T细胞扩增培养基中扩增10天。（A）最终得到的CD4+或CD8+ T细胞亚群来自于（A）静态培养（n=2），并添加两种ImmunoCult™ 人T细胞激活剂（流式图中的结果来自添加ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂的细胞）或（B）GE Xuri™细胞扩增系统W25（n=1），只添加了ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂。两种不同扩增流程没有导致细胞表型标志物的显著差异。

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