细胞凋亡检测指南

细胞发生早期凋亡时,细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸(PS)会从细胞膜内转移到细胞膜外,Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,对PS具有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS的外翻不是凋亡细胞所独特的,也可发生在坏死的细胞中。两种细胞死亡方式间的差别在于细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。PI或7-AAD染料可以通过细胞膜进入胞内与DNA结合。因此,可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合PI或7-AAD染料来检测细胞膜的完整性的检测方法。

1、此Annexin-VPI+—细胞发生机械损伤,细胞膜破损严重,Annexin-V染不上。

2、Annexin-V+PI+—细胞膜已经受损,PI染料可进入胞内与DNA结合,此时细胞已进入晚期凋亡或已经坏死,不可逆转。

3、Annexin-VPI-—真正的活细胞,对Annexin-V和PI都拒染。

4、Annexin-V+PI-—细胞只有PS外翻,细胞膜完整,对PI拒染,此时细胞只发生前凋亡,在撤走诱导因素下,可能逆转凋亡。

实验步骤：

1、细胞收集：悬浮细胞2~10*10⁵直接收集于离心管中,300 g/5min 离心,弃去培养液；贴壁细胞需要消化,若用胰酶消化不能添加EDTA,另禁止用细胞刮处理细胞,细胞刮会改变PS的外翻；

2、用冷PBS(提前放冰上预冷)洗涤细胞一次,300 g/5min 离心,弃去上清；

3、用1xbinding buffer 洗涤1次,300 g/5min 离心,弃去上清；

4、用100 μl的1xbinding buffer重悬细胞,加入5 μl Annexin-V 染液和5 μl 7-AAD染液(或PI),室温避光孵育10~15 min； 

5、加入300 μl的1xbinding buffer,上机检测,并于1 h内完成检测。

Tips：

1、检测贴壁细胞时,若不好控制消化时间,建议用Accutase细胞消化液,对细胞损伤小且不会改变细胞膜上PS的分布。

2、选择Annexin-V的荧光染料时要考虑细胞的自发荧光,特别是培养时间久或药物处理的细胞,一定注意细胞代谢物药物本身的荧光,一般来说细胞代谢物的自发荧光会干扰FITC/PE,所以可建议用Annexin-V APC,药物的干扰可查看药物本身的发射光谱是否会对检测选择的染料有影响。

3、细胞染色完成后,禁止固定,尽快检测完,可将检测管放冰上,可减少外界环境对检测结果的影响。

4、实验设计时,要考虑到补偿,设全单染管调节补偿,若是有不同的处理组,设置单染管时可从每个组中分别取一点细胞混合来染色。

5、若是第一次做药物对细胞凋亡影响的实验,建议做阳性对照组,可选择用Etoposide来诱导凋亡做为阳性对照。

6、在做凋亡统计时一般指统计前凋亡,因为只有前凋亡才有意义,当然也有文献统计总的凋亡比例(前凋亡和晚期凋亡和),单纯的统计晚期凋亡比例意义不大。

检测试剂盒：

推荐使用以下试剂盒：

推荐理由:

1、本试剂盒包含100 tests Annexin-V APC, 200 tests 7-AAD以及50 ml Binding Buffer。 

2、Annexin-V APC与7-AAD两种染料之间补偿干扰很小,染色操作简单,实验结果更准确。

3、7-AAD染料相比于PI染料粘稠度小,上样检测时样本之间干扰少。

4、即用型Binding Buffer,操作更方便。